还记得我们上一期讲过的Amplex Red吗？那个能精准检测过氧化氢（H₂O₂）和过氧化物酶的高灵敏度荧光探针？其实它能搞定的生化指标远比你想象得多。从常规的血糖、血脂、尿酸，到肝功能的转氨酶、肾功能的肌酐，再到神经递质、病毒蛋白酶，实验室里一半以上的常用生化指标，都能靠它完成检测。

这些检测的核心逻辑特别简单：只要待测物能通过某种酶促反应生成H₂O₂，就能用Amplex Red定量检测。不管是本身就能一步产H₂O₂的物质，还是需要多步级联反应转化的，只要选对反应，通通都能测。测代谢物就用代谢物做标准曲线搭配对应的酶，测酶活性就换成酶的标准曲线和对应的底物，最后通过荧光强度就能换算出样品中的准确含量。

今天我们就来全面梳理一下，Amplex Red到底能测哪些东西！

我们之前的公众号（点击查看）已经讲过Amplex Red过氧化物酶的基础检测逻辑，今天就具体说说两种最常见的过氧化物酶，以及它们的活性检测方法。

虽然各种过氧化物酶处理H₂O₂的具体方式不同，但有一点是完全相同的：它们的活性都会直接引起体系中H₂O₂含量的变化。只要有H₂O₂含量的变化，我们就可以通过添加已知量的H₂O₂底物，用Amplex Red检测体系中H₂O₂的剩余量或消耗量，从而定量算出这两种酶的活性。

基于Amplex Red靠H₂O₂出信号的逻辑，有一大类检测对象天生就特别适配这个体系。这些代谢物或者酶一步反应就能直接生成H₂O₂，完全不用绕弯子。这类物质包括丙酮酸、葡萄糖、尿酸等。

然而，更多的代谢物本身没有直接产生H₂O₂的反应路径，但这完全难不倒Amplex Red。我们可以曲线救国，通过多个连续的酶促反应，把原本无法直接检测的物质，一步步转化成能被Amplex Red识别的H₂O₂信号。只要找准对应的酶促反应节点，把不同的酶按顺序串联起来，理论上几乎所有代谢物都能接入这个检测体系。

丙酮酸（Pyruvic acid）是细胞代谢网络中最关键的枢纽之一，它一头连接着糖酵解的终产物，一头通向三羧酸循环，同时还是氨基酸代谢、糖异生和脂质合成的重要交汇点。基于前一节提到的丙酮酸检测原理和丙酮酸相关代谢通路，我们可以通过巧妙设计不同的酶促级联反应，将原本无法直接被Amplex Red识别的各种代谢物和酶，最终转化为可定量的H₂O₂信号。

丙酮酸激酶（PK）可以催化ADP与磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）反应产生丙酮酸和ATP。这个反应将ADP的定量转化为丙酮酸的定量，因而所有生成ADP的酶促反应，都可以通过这个级联体系进行Amplex red检测。这个方法可以直接检测ADP、PEP、PK。常见的间接检测指标包括琥珀酸（Succinate）、肌酸激酶（CK）、乙酸激酶（AcK）。

草酸脱羧酶（OXDC）催化草酰乙酸（OAA）脱羧形成丙酮酸和二氧化碳。这个反应将草酰乙酸转化为丙酮酸，因此所有生成草酰乙酸的酶促反应，都可以通过这个级联体系进行检测。这个方法可以直接检测OAA和OXDC。常见的间接检测指标包括三羧酸循环的起始物柠檬酸（Citric acid），以及临床肝功能的重要指标天冬氨酸（Asp）和天冬氨酸转氨酶（AST）。

除了上述两大分支外，丙氨酸转氨酶（ALT）相关的反应，也可以通过Amplex Red进行检测。ALT主要存在于肝细胞胞质中，当肝细胞受损时，细胞膜通透性增加，大量ALT释放入血，导致血清ALT活性显著升高。ALT与AST的联合检测，常用于诊断病毒性肝炎、脂肪肝、药物性肝损伤等肝脏疾病。

丙氨酸转氨酶（ALT）催化丙氨酸（Alanine）与α-酮戊二酸（α-Ketoglutarate, α-KG）反应生成谷氨酸（Glutamate）和丙酮酸。这个方法可以检测丙氨酸（Ala）、α-酮戊二酸（α-Ketoglutarate,α-KG）、ALT。

通过上游酶促反应将其他物质转化为葡萄糖，再利用上一节提到的葡萄糖检测原理，就可以延伸检测磷酸盐（Phosphate）、焦磷酸盐（Pyrophosphate）等关键代谢物，以及多种相关酶的活性。

任何能通过一步或多步酶促反应生成胆碱的物质，都可以接入这个网络实现定量检测，比如乙酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰胆碱及相关的酶。

我们之前的公众号文章（点击查看）已经详细介绍过胆固醇检测的各类方法，其中提到了胆固醇酶学试剂盒。目前市面上主流的胆固醇酶学试剂盒，几乎都采用Amplex Red进行下游的最终定量。

正如我们之前所讲，胆固醇酯的定量需要先检测样本中原有的游离胆固醇（FC）含量，再用胆固醇酯酶（Cholesterol esterase）把所有胆固醇酯（CE）都水解成FC，测出总胆固醇（TC）。而TC和FC的精确定量就靠H₂O₂，具体反应机制是游离胆固醇在胆固醇氧化酶（Cholesterol oxidase）的作用下发生氧化反应生成H₂O₂和胆甾烯酮（Cholestenone）。检测完成后，从TC中减去FC，即可得到样本中CE的准确含量。

肌氨酸（Sarcosine）代谢也是Amplex Red检测可以利用的级联反应。这个体系可同时覆盖肌酐、肌酸、肌氨酸及相关酶的活性检测，广泛应用于临床肾功能评估、肌肉代谢研究和前列腺癌早期筛查。

这个级联分为3步：

这个反应可以检测肌酐、肌酸、肌氨酸。

甘油三酯（Triglyceride）与高血脂、动脉粥样硬化、心肌梗死、脑中风、高血压、糖尿病、肥胖等几乎所有代谢和心血管疾病都密切相关。我们可以利用甘油三酯天然代谢路径中的3步连续反应，同时实现对甘油三酯、甘油（Glycerol）和脂肪酶（LP）活性的定量检测。

甘油三酯被脂肪酶水解成甘油和脂肪酸（Fatty acids）。甘油在ATP和甘油激酶（GK）的作用下磷酸化为甘油-3-磷酸（Glycerol-3-phosphate）和ADP。甘油-3-磷酸在甘油磷酸氧化酶（GPO）的作用下发生氧化反应，生成磷酸二羟丙酮（DHAP）和H₂O₂。

通过控制体系中添加的酶的种类，我们就能精准切换检测目标。仅添加甘油激酶和甘油磷酸氧化酶，可以直接检测样本中游离甘油的含量。同时添加三种酶，测得的就是总甘油三酯含量。加入过量甘油三酯底物，可以反向定量检测脂肪酶活性。

游离脂肪酸与肥胖、高脂血症、动脉粥样硬化、糖尿病等多种代谢性疾病相关。基于乙酰辅酶A合成酶和乙酰辅酶A氧化酶的两步级联反应，我们可以实现对游离脂肪酸和乙酰辅酶A合成酶活性的检测。

反应原理：乙酰辅酶A合成酶（ACS）催化游离脂肪酸（FFA）与ATP和辅酶A（CoA）反应，生成乙酰辅酶A（Acyl-CoA）、AMP和焦磷酸盐。生成的乙酰辅酶A进一步在乙酰辅酶A氧化酶（ACO）的作用下和氧气发生氧化反应生成2,3-反式烯醇辅酶A（2,3-trans-Enoyl-CoA）和H₂O₂。

神经氨酸酶（Neuraminidase）可以水解糖蛋白、糖脂链末端的唾液酸残基。流感病毒依靠它切割宿主细胞表面的唾液酸受体，从感染细胞释放并扩散，这也让它成为了奥司他韦、扎那米韦等经典抗流感药物的核心作用靶点。

基于Amplex Red的神经氨酸酶检测，采用的是唾液酸水解和半乳糖氧化的两步反应。糖蛋白底物（如胎球蛋白Fetuin）末端的唾液酸残基被神经氨酸酶水解，生成游离唾液酸和暴露末端半乳糖的糖蛋白。这里刚好可以复用我们上一节讲过的半乳糖检测原理。半乳糖氧化酶的底物范围其实很广，它不仅能氧化游离的半乳糖分子，同样可以氧化糖蛋白末端的半乳糖残基，并生成H₂O₂信号。这个体系主要用于定量检测神经氨酸酶的活性，是目前抗流感药物高通量筛选最常用的方法之一。

目前，Amplex Red可检测的指标已经覆盖了代谢、肝功能、心血管、神经系统等几乎所有生命科学研究领域。

希望这篇按反应逻辑整理的Amplex Red应用盘点，能帮你能快速定位目标物的检测原理，在实验设计时拓宽思路，在指标选择和方法优化上少走弯路，高效搞定各类生化检测。