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杨梅素低聚物触发

多受体介导的血脑屏障穿透和自噬调控以治疗缺血性卒中

近期，中国科学院长春应用化学研究所石强课题组在ACS Nano（IF:16.55）上在线发表文章Myricetin Oligomer Triggers Multi-Receptor Mediated Penetration and Autophagic Restoration of Blood-Brain Barrier for Ischemic Stroke Treatment，该项研究开发了一种掺有Ce的基于杨梅素低聚物的纳米材料(PC NPs)，其可以通过多受体介导穿透血脑屏障，然后上调保护性自噬重塑血脑屏障，调节卒中后微环境，从而起到治疗缺血性卒中作用。

本文研究中Annexin V-FITC/PI apoptosis kit由APExBIO提供。

研究背景

缺血性卒中是由于脑部血流供应受阻导致局部脑组织缺血缺氧，引起的一种急性脑血管疾病。它具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点，是全球主要的健康负担之一。

血脑屏障（BBB）是保护大脑免受有害物质入侵的重要屏障，但发生卒中时，BBB的完整性常常会受损使得血/脑物质交换失衡从而加重卒中。因此，修复 BBB完整性是治疗缺血性卒中的潜在策略。然而，BBB修复和药物递送之间存在矛盾，即BBB修复后，完整的BBB可能会阻碍药物进入大脑发挥作用。因此，开发能修复BBB完整性且在BBB完整时仍然拥有较强穿透能力的的新型治疗药物是当前研究的热点。

研究工作

1. 合成并表征PC NPs

杨梅素（Myr）是一种具有神经保护作用的化合物，其拥有很强的抗氧化作用。作者首先选择杨梅素为骨架合成杨梅素低聚物，然后与聚乙烯吡咯烷酮（PVP）组装成纳米结构PM NPs。进一步优化时，作者将Ce离子掺到PM中，得到具有高稳定性的胶体纳米结构PC NPs。随后通过一系列实验对PC NPs进行表征。

2.PC NPs具有强大的抗氧化能力

ROS和RNS（统称为RNOS）在体内的累积会导致氧化应激和炎症级联的过度激活，从而加重缺血性卒中。考虑到这点，作者首先对PC NPs的抗RNOS能力进行了检测。结果显示，PC NPs能够以剂量依赖方式有效清除多种ROS，包括H2O2, O2•−, and ·OH，且掺杂的Ce离子对清除ROS起到重要作用。类似的，DPPH和ABTS实验表明PC NPs能够以剂量依赖方式有效清除RNS。随后在多种细胞上检测了PC NPs的毒性，结果显示PC NPs具有良好的安全性，即使剂量高达1 mg/mL也无明显毒性。此外，MTT实验、ROS检测实验和线粒体膜电位检测实验显示在氧化应激下，PC NPs还可以起到降低细胞内ROS和维持线粒体功能，从而保护细胞。

总之，这些实验表明PC NPs可以通过降低细胞内ROS水平，从而修复因氧化应激而出现的线粒体损伤，最终起到保护细胞作用。

3.PC NPs可以有效抑制OGD/R引起的细胞损伤

缺血性卒中具有高致残率，在有效时间内实现再灌注对于治疗非常重要。但是再灌注很可能出现损伤从而加重病情。所以抑制缺血再灌注损伤具有重要意义。氧糖剥夺再灌注 (OGD/R)模型是一种常用于在细胞水平研究缺血再灌注损伤效应的模型。于是作者构建OGD/R模型以研究PC NPs的作用。当发生缺血性卒中，由于缺血缺氧，会导致细胞内钙超载。作者检测发现PC NPs可以有效的抑制OCD/R引起的钙过量并拮抗OCD/R引起的细胞死亡。随后，作者又通过ROS检测探针DCF和线粒体膜电位探针JC-1证明PC NPs同样可以清除因OCD/R引起的ROS，同时降低线粒体损伤。因为已知杨梅素可以通过激活NRF2/HO-1通路起到抗氧化作用，作者也探究了PC NPs是否具有相似的功能。WB结果表明PC NPs的确可以激活NRF2通路。且多种实验（Caspase-3活性检测，细胞死活染色和Annexin V检测）显示PC NPs可以抑制因OCD/R引起的细胞凋亡。

综上，PC NPs可以有效的对抗OGD/R引起的细胞损伤，从而保护细胞。

4.PC NPs可以激活自噬以保护血脑屏障

已知有报道显示在卒中时，适当诱导保护性自噬可以减缓卒中损伤。为了评估卒中中自噬的变化，作者通过AO这种酸性探针监测OGD/R模型和使用PC NPs后的自噬，结果显示PC NPs可以明显的提高自噬水平。此外，也有研究显示脑内皮细胞BECs中的自噬在缺血性卒中中对血脑屏障起到重要保护作用，其激活有利于TJs（紧密连接蛋白复合物）的表达和分布，这些蛋白主要包括ZO-1, Claudin-5和Occludin，与血脑屏障的完整性息息相关。作者通过一系列实验证明PC NPs处理会激活TJs蛋白以保护血脑屏障的完整性。

上述结果表明，PC NPs可以通过激活自噬增强对血脑屏障的保护。

5.PC NPs通过多受体介导穿过BBB

发生缺血性卒中之后，为了适应代谢紊乱，许多转运蛋白和受体经常被过度激活。

作者想探究PC NPs是否可以通过多受体介导从而更好的穿透血脑屏障。作者首先构建了一个血脑屏障模型并通过跨内皮电阻实验（TEER）验证了其可靠性。随后的荧光标记实验显示PC NPs的确可以穿过BBB并被细胞内吞。进一步探究PC NPs穿过BBB的机制时，作者发现其可以与缺血缺氧时BECs中过度表达的转运蛋白，如GLUT1，SGLT1，TfR，相互作用以促进其穿过BBB。

6.PC NPs具有抗炎效果

小胶质细胞作为大脑的免疫细胞，在缺血性卒中后被激活。激活的小胶质细胞通过极化成M1（促炎）和M2（抗炎）两种表型影响卒中的修复。调节小胶质细胞从M1转为M2是卒中治疗的关键。

为了探究PC NPs是否可以通过影响小胶质细胞极化从而调节免疫反应，作者首先用LPS刺激细胞产生M1表型（CD86+高表达），此时几乎无M2极化（CD206+高表达），然后通过免疫荧光和流式细胞术都验证PC NPs处理后可以有效的促进小胶质细胞的M2极化。进一步ELISA实验也发现PC NPs可以明显下调M1表型相关的因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6。此外，PC NPs可以有效减少细胞内的氧化应激产物。

综上这些结果都显示PC NPs可以有效促进小胶质细胞的M2极化，从而起到抗炎作用。

7.PC NPs对于缺血再灌注损伤的保护效果

为了探究PC NPs的体内治疗效果，作者首先通过小鼠单侧颈总动脉闭塞（UCCAO）建立了缺血性损伤模型，并验证了PC NPs具有很强的穿过脑组织能力，并且可以在卒中时有效的积累在大脑中。TTC实验显示PC NPs可以有效的降低梗死病变。随后，双侧颈总动脉闭塞（BCCAO）模型的HE染色、Nissl染色和免疫荧光染色则表明PC NPs可以有效的保护神经元。WB实验则显示PC NPs可以明显抑制模型组引起的凋亡。

总之，PC NPs治疗可以有效的缓解造模引起的神经元损伤。

8.PC NPs修复缺血再灌注引起的BBB损伤

血脑屏障BBB是大脑的保护屏障，可以防止有害物质进入大脑。在缺血再灌注之后，BBB的完整性和功能可能会受到破坏，导致病情加重。作者通过EB染色和免疫荧光发现BCCAO模型明显造成BBB损伤，而PC NPs处理后可以有效抑制这种损伤。进一步探究机制发现，PC NPs可以上调TJs蛋白复合物从而有效修复BBB完整性。

9.PC NPs调节小胶质细胞极化从而发挥抗炎作用

在之前的实验里，作者发现PC NPs可以在细胞水平上诱导小胶质细胞的M2极化，从而起到抗炎作用。这里作者对PC NPs的体内抗炎作用进行探索。BCCAO造模会引起明显的小胶质细胞M1表型（促炎），但是使用PC NPs后可以明显看到M2表型（抗炎）的增加。WB实验和ELISA则证明PC NPs可以显著抑制iNOS等炎症反应因子。

总之，PC NPs可以在体内诱导小胶质细胞的M2极化，同时抑制NF-κB通路，从而逆转缺血再灌注后的炎症微环境。

研究结论

PC NPs作为一种新型的纳米制剂，通过其独特的多受体介导的BBB穿透机制和诱导保护性自噬，为缺血性卒中的治疗提供了一种潜在的策略。该研究展示了PC NPs在修复血脑屏障、减少脑损伤、调节炎症反应和保护神经元方面的潜力。未来的研究可以进一步探索PC NPs的临床应用潜力，以及其在其他神经退行性疾病中的治疗效果。此外，PC NPs的设计理念和研究方法为血脑屏障穿透药物递送系统的发展提供了新的思路和实验依据。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.3c09532