-上下滑动查看-

阳性对照和阴性对照是HTS的必要参照物，因为后续所有化合物的活性计算的都需要参照它们的信号强度进行，每块板实验结果的可靠性也要通过它们来检验。

阳性对照一般选用对当前实验模型或靶点已有明确强效活性的已知化合物，提前查阅相关文献可以找到合适的阳性对照选型。阳性对照测出的信号，就作为整板实验的最大效应基准点（Highest Possible Effect，HPE）。

阴性对照通常直接用实验所用的溶剂，用来排除溶剂本身带来的干扰影响，最常见的就是DMSO。阴性对照的信号，则对应实验的零效应基准点（Zero Percent Effect，ZPE）。

HTS跑一次下来，动辄就要消耗上万份化合物耗材，不仅自动化仪器要长时间占用工时，人力与运维成本也很高。一旦前期实验条件参数设置出了纰漏，很可能整轮筛选实验直接作废。提前做好预实验，校准条件，排除隐患，才能避免巨额经费打水漂。

DMSO是化合物筛选里的常用溶剂，但它的浓度一旦超标，就会导致实验翻车。DMSO可以毒死细胞，还会造成生物样本变性，最终引发实验信号紊乱，甚至完全没信号。在细胞毒性实验里，这种问题还会导致彻底分不清结果到底是化合物本身的作用，还是DMSO毒性带来的假阳性。所以在正式筛选前，一定要测试不同浓度DMSO对体系的干扰情况。

化合物的孵育时长也是需要重点摸索的参数。化合物的孵育时间太短，化合物和靶点没法充分作用，很容易出现响应不足，造成假阴性漏筛，错失有效候选分子；孵育时间过长，容易诱发次级细胞毒性，还会导致实验样本降解，信号衰减。因此我们需要摸索出小分子的最佳作用时长，保障筛选结果稳定可靠。

在HTS中，化合物浓度设置直接决定实验数据的可靠性。浓度太高容易引发非特异性结合和额外细胞毒性。浓度太低会让化合物和靶点结合不充分，导致信号不够强。不论是阳性对照还是主筛体系，都需要先优化浓度。

HTS一块板上几百上千个孔挤在一块，特别容易出问题：比如板内各个孔的信号高低不齐，边缘孔和中间孔的信号差别明显（边缘效应），还经常会出现整行整列信号渐进漂移的情况。所以正式开展筛选工作前，一定要先做好板均一性验证。

全新搭建的实验体系需要连续做3天独立重复验证。对于已经定型跑通的成熟体系，只要搁置很久重新启用，或是更换实验场地、改动部分实验条件，都需要连续开展2天独立验证。验证板会采用三套完全不同的H/M/L循环交错布板方案。H就是HPE，M采用EC50浓度的阳性对照，L则对应ZPE。

板均一性验证合格标准是离群孔占比低于2%，CV变异系数不超过20%，信号漂移与边缘效应也要控制在20%以内，而最核心的硬性要求是整板Z'>0.5。

初筛（Primary Screening）简单来说就是对整库海量化合物开展全覆盖式批量海选，从成千上万的化合物中快速捞选出具备潜在靶向活性的候选分子，也是新药研发早期最关键的一轮大范围摸排。

等到前期预实验摸索的各项实验参数、体系质控标准全部达标，确认实验体系稳定可靠后，便可正式启动大规模初筛。提前备好全套化合物库板与实验样本板，做好前期排布与准备工作，随后即可批量上机，进行首轮大规模筛选。

正式上机筛选前，首先要逐一检查化合物母板，仔细排查是否存在沉淀、浑浊、变色等外观异常的化合物，提前规避这类异常样本干扰整体筛选数据。母板核验无误后，再按照设计好的排板方案（Plate Map）把化合物从母板转移到工作板中进行稀释处理，业内更推荐用自动化工作站进行纳升级分液，精准度高、还能减少人工操作误差。

HTS不同实验模型的生长特性、作用机制完全不同，对应的铺板时机、操作方式和前期准备标准也各不相同。

不管是细胞还是细菌，都得提前培养到活性最佳的对数生长期。像需要长时间孵育的细菌，还有常规贴壁细胞，都要提前24小时完成铺板，留出充足时间让它们的生长状态稳定下来。

而酶、蛋白这类生化无细胞筛选体系就不一样了。这类样本关键要做到现配现用，防止放置过久造成蛋白活性衰减。靶点蛋白和酶类试剂建议提前分装保存，按需解冻使用，切忌反复冻融，避免影响后续实验数据的准确性。

直接按照预实验敲定好的参数条件，把小分子化合物加到已铺好样本的微孔板中，这一步一般用自动化移液工作站批量整板加样。加样完毕离心混匀后，放入细胞培养箱或生化培养箱静置孵育即可。

孵育完成后，直接按照之前选定的流程对微孔板开展上机检测即可。如果待检测的板子数量比较多，不要一次性全都从培养箱拿出来，建议分批取板操作，避免温度波动和孔内液体蒸发。

拿到筛选原始数据后，需要先统一核算每块板的Z'值以及各化合物的活性水平，Z'>0.5才算体系合格。Z'值不达标，或是数据明显反常的板子，都要单独挑出重新做。

完成板体质控之后，就计算活性，从而筛选出有效的候选化合物（Hit）。Hit通用判定方式主要有两种：

化合物的活性可以按照以下公式计算：

由于初筛多为单浓度的快速检测，很容易受体系轻微波动、化合物自身杂质、仪器操作误差等因素影响。这就使得初筛筛选出的阳性Hit中，掺杂了大量无效的假阳性结果，因此必须将初筛命中的Hit拿出来再测一遍，这就是复筛(Secondary Screening)。复筛实验的阴阳对照设置和数据分析规则与初筛一致。

如果需要验证的化合物数量较多，直接沿用初筛的给药浓度，同时将实验复孔提升至3–4个，按照和初筛完全一致的实验流程重复测试即可。

如果待测化合物数量较少，可直接开展简易多点浓度梯度实验（mini-CRC）。一般设置3–5个浓度梯度就足够，常用梯度方案1 μM、3 μM、10 μM，或0.3 μM、1 μM、3 μM、10 μM。

经过复筛反复验证、确认有效的苗头化合物，就需要进一步弄清楚它到底多强、多好。此时需要搭建完整的浓度-反应曲线（CRC），常规设置8–12个梯度浓度；以10-100 μM作为最高起始浓度，按照1:2或1:3的比例进行梯度稀释，且每个浓度至少设置2–3个复孔。最后通过拟合量效曲线，计算出化合物的EC50数值。

看完这篇硬核干货，相信你已了解HTS从实验设计到Hit验证的完整流程，理清了每个环节的核心质控点和常见坑点！希望这篇文章能帮你避开HTS路上的那些坑，快速高效地筛选出优质的苗头化合物，为后续的药物研发工作打下坚实的基础。

APExBIO化合物库，严选优质稳定小分子，覆盖肿瘤、免疫、神经等热门研究领域，提供现货直发和定制化服务，持续多年助力全球科研工作者在顶级期刊发表研究成果，是您HTS实验的可靠伙伴。