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一种用于癌症治疗的靶向METTL3-METTL14复合物结合界面的多肽抑制剂

近期，湖南大学生命科学交叉研究院张定校课题组和史俊峰课题组在国际知名期刊Angewandte Chemie International Edition（IF:16.6）上在线发表文章A Stapled Peptide Inhibitor Targeting the Binding Interface of N6-Adenosine-Methyltransferase Subunits METTL3 and METTL14 for Cancer Therapy，该项研究基于METTL3-METTL14复合物设计并优化得到了一种新型多肽抑制剂RSM3，体内外实验表明RSM3能够显著杀伤肿瘤并抑制肿瘤进展。这一发现为癌症治疗提供了一种新的方向。其中TUNEL staining（K1134）由APExBIO提供。

研究背景

N6-甲基腺苷（m6A）是一种普遍存在的RNA修饰，在多种生物过程中发挥着至关重要的调节作用。已知m6A调节失常与多种疾病的发生发展密切相关（如癌症）。METTL3-METTL14甲基转移酶复合物是催化m6A的关键元件，前者为主要催化亚基，而后者执行RNA结合功能。许多研究表明，METTL3在多种癌症中显著上调，并与其恶性进展成密切相关，如急性白血病、肝癌、胃癌、肺癌、结直肠癌和前列腺癌。这表明其可能是治疗癌症的潜在靶点。

虽然2016年METTL3-METTL14复合体的晶体结构就已被解析，但是METTL3抑制剂的开发仍然进展缓慢。2021年英国STORM Therapeutic开发得到了首个小分子METTL3抑制剂STM2457，该抑制剂在高通量筛选中显示出对急性髓系白血病的高活性，但其对实体肿瘤的疗效仍缺乏验证。后来陆续又报道了一些METTL3小分子抑制剂可以显著肿瘤细胞生长，如Sinefungin、UZH2和Eltrombopag，但这些小分子的体内疗效仍需要进一步研究。因此，开发新型的METTL3高效抑制剂仍然是当务之急。相比于传统的小分子化合物，多肽药物具有高特异性和良好的生物安全性，而且可以作用于传统意义上不可成药的蛋白-蛋白相互作用界面。开发高效的METTL3多肽抑制剂具有重要研究意义。

研究工作

1.多肽抑制剂设计与验证

作者对METTL3-METTL14（PDB: 5IL1）的晶体结构进行解析后确定了两个对形成蛋白-蛋白相互作用（PPI）至关重要的结构域interface loop (M1, residues 462-479)，helix α2 (M3, residues 435-447)和另外一个底物催化中心 (M2, residues 534-541)，并以这三个结构设计了三种多肽抑制剂RM1、RM2和RM3。这些多肽抑制剂结合了穿膜肽以便于细胞内递送。

考虑到METTL3在前列腺癌（PCa）中高表达，作者选择了两种前列腺癌细胞PC3和DU145细胞进行多肽抑制剂的活性验证。MTT实验显示RM3对这两种肿瘤细胞的抑制效果最好，其对PC3和DU145细胞的IC50分别为35.4 µM和55.3 µM。进一步的克隆形成实验也证实了RM3可以显著抑制这两种细胞的增殖。

2.M3衍生肽的体外活性

已知订书肽化可以提高多肽的稳定性和活性。为了进一步增强多肽抑制剂的效果，作者对RM3进行优化得到了订书肽化的RSM3。作者先是通过微量热电泳（MST）分析了RM3和订书肽化的RSM3对METTL3-METTL14复合物的亲和力，结果显示RSM3比RM3具有更强的亲和力，其Kd值为3.1 µM。圆二色谱（CD）实验也进一步证明了这点。随后的m6A功能分析显示RSM3可以显著抑制METTL3-METTL14复合物的活性。稳定性实验则表明RSM3比RM3更稳定。此外，作者还对RSM3做了溶血实验，结果显示即使浓度达到200 µM，RSM3对细胞也是低毒性的。

总之，这些实验都证明RSM3是一种比RM3效果更好的抑制剂，可以用于进一步的抗肿瘤活性研究。

3.RSM3的体外抗肿瘤活性验证

为了进一步探究RSM3的抗肿瘤活性，作者首先在一系列肿瘤细胞中测试了RSM3的杀伤能力。结果显示RSM3具有广谱的抗肿瘤能力，且杀伤能力比RM3更强。随后的克隆形成实验、划痕实验、EdU增殖实验进一步证明了相比于RM3，RSM3具有更强的抑制肿瘤细胞增殖和侵袭能力。Tunel实验则表明RSM3和RM3都可以诱导肿瘤细胞凋亡，同时RSM3的诱导效果更好。

4.RSM3结合METTL3-METTL14复合物并降低复合物稳定性和抑制复合物功能

为了继续探究RSM3的作用机制，作者进行了荧光共定位实验并发现RSM3处理会使METTL3和METTL14的信号变弱，因此作者推测RSM3处理可能会使METTL3-METTL14复合物降解。随后的WB实验证实了这一假设，即RSM3处理后，METTL3和METTL14的蛋白水平都显著降低。RNA斑点杂交实验显示RSM3处理显著降低m6A修饰能力。这些结果共同证明RSM3可以显著抑制METTL3的功能。

之后作者继续探究RSM3对METTL3半衰期的影响，并通过使用蛋白质合成抑制剂CHX、自噬抑制剂CQ和蛋白酶体抑制剂MG132证明RSM3是通过蛋白酶体降解途径促进METTL3降解。同时他们还同时使用之前报道的METTL3小分子抑制剂STM2457进行实验，发现STM2457几乎不会影响METTL3的蛋白水平。这说明RSM3是一种与STM2457作用机制不同的METTL3抑制剂。

以上结果表明RSM3可以干扰METTL3-METTL14复合物并使其降解，同时抑制复合物的m6A修饰功能。此外RSM3可以通过蛋白酶体途径降解METTL3，这是与之前发现的小分子抑制剂STM2457完全不同的作用机制。

5.RSM3对肿瘤细胞转录组的影响

为了进一步揭示RSM3的分子作用机制，作者进行了RNA测序、GO分析、GSEA分析和WB实验等实验。结果显示RSM3可以以m6A依赖的方式，通过抑制MAPK通路和诱导分化促进肿瘤细胞的凋亡，从而抑制肿瘤细胞增殖。

6.RSM3体内抗肿瘤活性和安全性探索

在进行体内抗肿瘤活性实验之前，作者首先测试了RSM3的急性毒性。对小鼠注射RSM3（50 mg/kg）24h后分析发现其白细胞WBC、血小板PLT和红细胞RBC与未注射组几乎没有显著区别，血红蛋白HGB虽有降低，但也在可接受范围内，这证明了RSM3的安全性。随后通过PC3异种移植瘤模型测试RSM3的体内抗肿瘤活性，结果显示RSM3可以显著抑制肿瘤的生长且不影响小鼠体重。免疫组化分析显示RSM3处理显著抑制了METTL3表达和m6A修饰，同时显著增加了Caspase-3的表达。

这些结果表明RSM3具有很强的抗肿瘤活性，并且具有较好的安全性。

研究结论

简而言之，本项研究首次报道了一个高效的METTL3的多肽抑制剂RSM3并通过体内外实验证明了其可以显著抑制肿瘤生长。这个发现为开发新的肿瘤治疗药物提供了一个新的思路。

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202402611