脂质纳米颗粒和RNA干扰：推动基因治疗发展新纪元
引 言
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种重要的生物基因沉默机制，通过特定的小分子RNA（如siRNA和miRNA）降解靶mRNA分子或抑制其翻译，从而调控基因的表达。理论上，siRNA能够特异性地阻断任何致病蛋白的合成，针对遗传性疾病、癌症和病毒感染等各类疾病的治疗潜力巨大。然而，siRNA等寡核苷酸本身容易被核酸酶降解、稳定性差以及难以将其递送到靶组织等诸多障碍一直影响其应用，因此，开发高效递送系统将siRNA稳定递送到靶细胞或靶器官是提高RNA药物疗效的关键。
图1 siRNA在体内的递送障碍
siRNA可能被肝脏和肾脏等器官隔离或排泄，限制它们的分布以及到达目标组织的有效性；血液中存在的核酸酶可以降解siRNA分子，使其在到达预定目标之前失效；一旦被靶细胞内化，siRNA在逃离内溶酶体时可能会遇到挑战。
RNAi基因沉默机制
RNAi利用细胞自身的分子机制，通过短干扰RNA来高效敲低靶基因的表达水平。在这一过程中，由外源途径引入或内源性转录生成的双链RNA(dsRNA)经Dicer酶切割生成长度约21-23个核苷酸的siRNA，或由内源性基因转录产生的初级miRNA，经RNA聚合酶II或III转录后通过Drosha和Dicer酶的处理而生成的成熟miRNA，与Argonaute蛋白等组成的沉默复合体(RISC)识别并降解目标mRNA或抑制其翻译。其中siRNA引导的RISC复合体识别并与目标mRNA序列完全互补，导致mRNA被切割降解，而miRNA通过RISC复合体与目标mRNA互补性通常不是完全的，使得目标mRNA的翻译被抑制而不是直接被降解。RNAi可由病毒载体、质粒表达或直接体外合成siRNA等方式进行。
图2. RNAi机制和RNAi递送方式的切入点
左边显示RNAi途径和siRNA的形成，右侧显示基于DNA或基于RNA的RNAi疗法的不同方式，这些核酸药物进入细胞并被装载到RISC中以介导靶mRNA的同源依赖性降解。基于DNA的RNAi的递送平台包括编码Pol II驱动的miRNA模拟物或Pol III驱动的shRNA的病毒和非病毒载体。以RNA为基础的递送方式以Galnac偶联、修饰或未修饰的Dicer底物的裸siRNA直接递送或通过纳米颗粒（脂质或聚合物）的形式递送。
siRNA递送系统
目前常用的siRNA递送包括病毒和非病毒载体这两类。病毒载体转染效率较高，但潜在的安全风险、机体免疫反应、载荷容量限制等阻碍其在基因治疗方面的应用。相较而言，非病毒载体因其更安全、低免疫原性、易制备、载荷灵活以及允许重复给药等优势推动了基因治疗的发展。目前，可电离脂质纳米粒作为主要的非病毒类核酸递送系统，在提升siRNA成药性上发挥了重要作用，挖掘其应用系统治疗的巨大潜力。多项基于LNP的RNA药物的疾病临床研究已在世界范围内开展，这其中包括已经获批上市的三款LNP递送的RNA药物，即Alnylam公司的Patisiran (ONPATTRO™)（siRNA药物）、辉瑞公司的BNT162b2和Moderna公司的mRNA-1273（均为mRNA疫苗）。
图3. 病毒和非病毒载体的优劣势比较
LNP-siRNA组成
LNP由电离或阳离子脂质、辅助磷脂、聚乙二醇(PEG)脂质和胆固醇组成，其功能活性与所使用的可电离脂质的pKa密切相关。可电离脂质通常含有酸解离常数(pKa) 为6.2-6.5的可电离氨基头部，在pH < 6.0时，脂质可电离的氨基头被质子化并带正电荷，使其在酸性pH下对RNA的包封效率很高，而在生理条件下(pH = 7.4)则是中性的，由此产生的表面带中性电荷的LNP其毒性降低。
图4. 一种LNP-siRNA结构示意图。通过微流体系统可以将有机溶剂中的脂质混合物和水溶液中的小干扰RNA (siRNA)结合来制造LNPs。然后通过水透析除去有机溶剂。透析后LNP核包裹siRNA。
值得注意的是，相比其他被报道的可电离阳离子脂质，目前使用二甲基-4-二甲氨基丁酸酯(DLinMC3-DMA)合成的LNP仍是最有效的siRNA递送系统之一。研究报道DLin-MC3-DMA的应用可以大幅降低siRNA的剂量，同时提高siRNA在肝等组织中的基因沉默效率。另外引入的胆固醇和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)等常见辅助磷脂可进一步提高LNP的稳定性，聚乙二醇化脂质则通过避免颗粒聚集来提高LNP储存的稳定性。
图5. 三种临床应用核酸药物的LNP递送中脂质成分的结构和摩尔比例
LNP-siRNA制备
目前siRNA、miRNA等寡核苷酸的LNP包被方式包括乙醇注射、过膜挤压及微流控等，其中微流控法因稳定可控、条件温和、简单快速以及重复度高等优势而成为制备LNPs最合适的技术，加速了基于LNP纳米药物的发展。制备过程包括将含有可电离阳离子脂质、胆固醇、辅助磷脂和PEG脂质(其摩尔比分别为40-50%: 40-30%: 10%: 10-1%)溶于乙醇溶液，与含有寡核苷酸的酸性水缓冲液(如柠檬酸缓冲液, pH=4)快速混合。其中氨基脂质与寡核苷酸的磷酸盐摩尔比，即氮磷比(N/P)为6，核酸水溶液与乙醇脂溶液的体积比例通常为3:1。水/脂混合后，得到的LNP首先在pH为4的缓冲液中透析以去除残留的乙醇，然后再在pH为7.4的缓冲液中继续透析以将pH提高到生理值。
图6. LNP-siRNA的微流控混合组装
酸性缓冲液使可电离的阳离子脂质(蓝色)质子化，然后通过静电相互作用在siRNA(红色)周围形成一个反向胶束。随着溶剂极性的增加，反胶束开始聚集，随后被PEG脂质(紫色)包裹形成LNP-siRNA。微流控允许水/脂液体流在毫秒时间尺度快速混合，具有更高的封装效率(>90%)，生成的颗粒更小，并且可以实现小规模生产。
微流控纳米制备仪RM1001
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肝靶向和非肝靶向
含有可电离阳离子脂质的LNP siRNA系统在体内主要积累到肝脏中，这一过程和LNP表面吸附的载脂蛋白E (ApoE)密切相关。LNP-siRNA系统可在野生型小鼠中引起基本完全的肝细胞基因沉默；但在ApoE敲除鼠中则很少或没有基因沉默现象，而经ApoE预孵育后则可恢复沉默效应，表明LNP siRNA系统通过吸附内源性ApoE，和含有ApoE结合配体的受体结合触发肝细胞的摄取。
实际上，LNP表面电位和/或内部电荷会影响其组织选择性和器官趋向性，通过改变LNP的表面性质(如电荷)以特异性地积聚到目标器官或组织中已经得到广泛研究，如Siegwart等人通过在四组分LNP中仅添加选择性器官靶向（SORT）分子可实现肺、脾和肝脏的靶向递送。如图7所示，永久性阳离子SORT脂质(DDAB、EPC和DOTAP)的加入可将组织偏向性从肝脏转移到肺。永久性阴离子型SORT脂质(14PA、18BMP和18PA)的添加实现了对脾脏的特异性递送，适当的离子化阳离子型SORT脂质(DODAP和C12-200)增加肝脏的靶向。令人兴奋的是SORT技术是普遍适用的，极大的促进基于LNP的多种肝外器官靶向设计的快速发展。
图7.在传统LNPs中添加一种补充成分(称为SORT分子)，系统地改变了体内递送谱，并根据SORT分子的百分比和生物物理特性介导组织特异性递送（A）。iphone脂质设计指导LNP组织靶向。两性离子iphone脂质在带正电的叔胺上含有两条脂质尾巴，在带负电的磷酸基上含有一条脂质尾巴。改变烷基脂链长度会影响组织靶向肝脏、肺和脾脏，这被称为选择性器官靶向(SORT) (B)
LNP RNAi的应用
LNP-RNAi因其高效、特异性的基因沉默能力，在医学研究和治疗中展现出巨大的潜力。随着研究的深入和技术的进步，预计将有更多基于LNP RNAi的治疗方法被开发出来，为许多之前难以治疗的疾病提供有效的治疗方案。以下是LNP RNAi技术的一些关键应用领域：
1. 遗传疾病治疗
LNP RNAi可以用来治疗一些遗传性疾病，通过特异性地沉默病理性基因的表达来纠正疾病表型。例如，临床用于治疗遗传性淀粉样变性病和某些形式的遗传性失明。
2. 癌症治疗
在癌症治疗中，LNP RNAi可以用来靶向并沉默那些在癌症发展和扩散中起关键作用的基因。通过抑制这些基因的表达，可以阻止肿瘤的生长和扩散。
3. 传染病治疗
LNP RNAi技术也被用于针对病毒性基因的沉默，以治疗各种病毒性疾病。例如，针对HIV、乙型肝炎病毒（HBV）和流感病毒的研究已经显示出了积极的结果。
4. 炎症性疾病
通过沉默在炎症反应中起关键作用的基因，LNP RNAi技术可以用于治疗各种炎症性疾病，如自身免疫性疾病。
5. 靶向药物递送
LNP技术不仅限于RNAi递送，还可以用于递送其他类型的治疗分子，如mRNA疫苗和CRISPR/Cas9基因编辑工具，为疾病治疗提供了新的可能性。
6. 罕见疾病的治疗
由于LNP RNAi技术能够精确地靶向特定基因，因此它为一些罕见疾病的治疗提供了新的希望，这些疾病之前可能没有有效的治疗方法。
图8. 基于siRNA的不同疾病药物的批准和临床试验项目
结 论
LNP RNAi技术因其高效的基因递送能力和广泛的应用前景，正在成为基因治疗领域的一个重要分支，但核酸的内体逃逸效率较低以及LNP的长期储存和长途运输困难等缺陷仍亟需解决。随着研究的深入和技术的进步，预计将有更多基于LNP RNAi的治疗策略进入临床应用，为治疗各种疾病提供新的解决方案。
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