双荧光素酶在验证miRNA与靶基因结合中的应用
双荧光素酶在验证miRNA与靶基因结合中的应用
荧光素酶作为一种理想的报告基因工具，被广泛应用于转录因子结合位点与启动子活性分析、RNA降解、信号转导、药物筛选、动物活体成像等领域。前两期为大家介绍了荧光素酶的发展、原理以及在启动子活性及与转录因子结合方面的应用。本期就来详细聊聊双荧光素酶在miRNA与靶基因结合方面的应用。
MicroRNA（miRNA）是植物和动物细胞中自然产生的18-25个核苷酸的小型非编码单链RNA，其是由长约75 nt的茎环结构前体RNA被Dicer RNase酶切而成。这些miRNA通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA的3’UTR，根据互补的程度指导沉默复合体降解靶基因或阻碍mRNA的翻译。
在miRNA与靶基因互作研究中，双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告基因技术发挥了重要作用。该技术利用荧光素酶作为报告基因工具，可以定量检测miRNA对靶基因的调控效果，为研究miRNA功能和机制提供了有力工具。
研究者可以构建含有靶基因 3'UTR 区域的报告载体，并将miRNA转染至细胞中，通过检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性比值 ，评估miRNA对靶基因的抑制作用。可以理解为通过荧光值来判断miRNA是否与靶基因结合。通过将预测能够与miRNA结合的靶基因3’-UTR序列插入载体中萤火虫荧光蛋白的3’-UTR。当miRNA和质粒中的插入序列结合后，miRNA会通过和所插入的序列结合从而抑制萤火虫荧光蛋白的翻译最终造成荧光值的降低。
这里我们将为大家介绍如何预测某个miRNA的靶基因并通过实验来进行验证 。该验证流程大致如下：
一、miRNA与靶基因的生物信息学预测
一般项目从完整性和可行性的角度考虑，都可以先通过生物信息学的手段来预测一下我们前期的猜测是否可信。基于生物信息学分析软件或者在线网站来分析特定靶基因的3’-UTR区序列是否有miRNA结合位点，常用的分析软件有TargetScan、StarBase和miRanda 等。
二、载体构建
将靶基因的3’-UTR区克隆到载体上，注意设置相应的对照。
三、miRNA模拟物合成
四、转染组别设置如下
（hsa-miR-B靶向A验证）
五、双荧光素酶报告基因检测
检测时，每个样本建议做3次重复。具体操作步骤参考双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书。
六、案例分析
在这里，我们就以文献为例，跟大家一起来学习下在文献中是怎么分析的。
M6A-mediated upregulation of LINC00958 increases lipogenesis and acts as a nanotherapeutic target in hepatocellular carcinoma.
该研究发现了一个与脂肪生成相关的lncRNA-LINC00958，其在HCC细胞系和组织中的表达上调。功能分析显示，在体外和体内实验中LINC00958的上调均加重了HCC的恶性表型。但是LINC00958是否受到miR3619-5p的干预从而影响HCC脂肪的形成和进展的机制尚不明确，因此该文章通过采用双荧光素酶报告基因检测技术来阐明潜在的分子机制。 
图E：推测LINC00958与miR-3619-5p之间的结合序列。
图F：将含有WT或MUT LINC00958转录本的荧光素酶报告基因以及空白pmirGLO与miR-3619-5p模拟物或miR-control共转染。采用双荧光素酶报告系统测定荧光素酶活性。
结果：该实验生成了一个不能结合miR-3619-5p的LINC00958突变序列，用于随后的荧光素酶报告基因检测(图E)。
结果显示，miR-3619-5p模拟物在转染野生型LINC00958序列的HCC细胞中显著降低了荧光素酶活性，而在转染突变型LINC00958的HCC细胞中，荧光素酶活性没有明显改变(图F)。在机制上得出LINC00958结合miR3619-5p上调肝癌源性生长因子的表达，从而促进HCC脂肪的形成和进展。
结 语
在进行了关于双荧光素酶报告基因研究miRNA与靶基因互作的探讨之后，我们不禁感叹科学的奇妙和无限可能。通过双荧光素酶报告基因技术，我们能够深入了解miRNA在调控基因表达中的作用机制，揭示生物体内复杂的基因调控网络。
miRNA与靶基因之间的互作关系在细胞生物学和疾病发生发展中扮演着重要的角色。通过双荧光素酶报告基因技术，我们可以精确地评估miRNA对靶基因的调控效果，为疾病的发生发展和治疗提供了新的思路和靶点。
然而，科学研究的道路上永远都有更多的挑战等待着我们去攻克。在未来的研究中，我们将继续努力，进一步完善双荧光素酶报告基因技术，探索miRNA与靶基因互作的更深层次机制，为人类健康和生命科学的发展贡献我们的力量。
让我们携手并肩，以科学的探索精神，探索未知的领域，拓展人类的认知边界，共同创造更加美好的未来！
参考文献:
1.M6A-mediated upregulation of LINC00958 increases lipogenesis and acts as a nanotherapeutic target in hepatocellular carcinoma.
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