【期刊】Advanced Materials

【IF值】27.4

【DOI】10.1002/adma.202417831

本论文用到的报告基因Fluc mRNA(Catalog No. R1013/R1010)以及荧光素底物(Catalog No. C3654)由APExBIO提供。

心肌梗死后，心脏组织发生严重的纤维化反应，过度激活的成纤维细胞（CFs）大量增殖并分泌胶原蛋白，形成瘢痕组织，导致心肌僵硬、心功能下降。研究发现，成纤维细胞激活后会高表达一种名为成纤维细胞活化蛋白（Fibroblast Activation Protein, FAP）的特异性标记物。因此，FAP成为治疗心脏纤维化的理想靶点。

CAR巨噬细胞疗法通过在巨噬细胞表面表达特异性识别FAP的嵌合抗原受体（CAR），能够精准识别并吞噬FAP阳性的激活成纤维细胞，从而抑制纤维化进程。然而，心肌梗死后大量凋亡细胞的存在，使得巨噬细胞的吞噬负担过重，导致CAR巨噬细胞无法高效地清除激活的成纤维细胞，严重限制了其抗纤维化效能。

图1 心肌梗死小鼠模型的心脏FAP表达显著增加，提示FAP可能是纤维化治疗的潜在靶点

为解决上述难题，研究团队创新性地提出通过原位工程化Legumain蛋白，显著增强CAR巨噬细胞的吞噬效能。

Legumain是一种内溶酶体半胱氨酸蛋白酶，能够促进巨噬细胞吞噬体与溶酶体的融合，加速吞噬货物的降解，从而提高巨噬细胞的吞噬效率。

研究团队设计了一种新型脂质纳米颗粒LNPs递送系统，通过静脉注射将编码Legumain和抗FAP CAR的mRNA精准递送至心肌梗死区域的巨噬细胞中，实现原位生成具有增强吞噬效能的CAR巨噬细胞（Lgmn/CAR-MΦ）。这种策略不仅简化了CAR巨噬细胞的制备过程，还避免了传统细胞疗法的复杂操作和高昂成本。

研究团队首先设计合成了一种新型离子化脂质（D-2），并利用微流控技术制备了具有心肌梗死区域和巨噬细胞双重靶向功能的脂质纳米颗粒（MPEP-S2P/LNPs）。体外实验表明，这种LNPs具有良好的稳定性、生物相容性和高效的mRNA递送能力。

图2  MPEP-S2P/LNPs递送系统的结构和表征

研究人员利用LNPs将编码Legumain和抗FAP CAR的mRNA递送至巨噬细胞中，成功实现了CAR和Legumain蛋白的高效表达（图3 F）。体外吞噬实验结果显示，工程化后的Lgmn/CAR巨噬细胞对FAP阳性细胞的吞噬能力显著提高，是单纯CAR巨噬细胞的2.1倍（图3 i-j），证实了Legumain对吞噬效能的显著增强作用。

图3 CAR的表达和体外CAR-MΦs的效应活性

研究团队进一步在小鼠心肌梗死模型中验证该策略的治疗效果。结果显示，Lgmn/CAR巨噬细胞治疗组的小鼠心功能显著改善，心脏射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）明显提高，心肌梗死面积显著减小，心脏纤维化程度明显降低。此外，Lgmn/CAR巨噬细胞治疗组的小鼠存活率也显著提高，表明该策略具有良好的治疗效果和安全性。

图4  LNPs递送Lgmn/CAR后对MI小鼠存活、心功能和梗死大小的治疗效果

研究团队利用单细胞测序技术进一步揭示了Lgmn/CAR巨噬细胞治疗心脏纤维化的机制。结果表明，Lgmn/CAR巨噬细胞能够显著提高巨噬细胞的吞噬体-溶酶体融合效率（图5 h），加速吞噬货物的降解，从而有效清除FAP阳性的激活成纤维细胞，抑制纤维化进程。

图5 scRNA-Seq揭示了原位生成的CAR-MΦs对CFs的影响及其异质性

本研究首次提出通过原位工程化Legumain蛋白，显著增强CAR巨噬细胞的吞噬效能，有效治疗心肌梗死后的心脏纤维化。这一策略不仅克服了传统CAR巨噬细胞疗法吞噬负担过重的瓶颈问题，还简化了细胞疗法的制备过程，具有良好的临床转化前景。未来，该策略还可进一步拓展至其他纤维化疾病的治疗，如肝纤维化、肾纤维化等，为纤维化疾病的治疗提供新的思路和方法。