miRNA 是一类长度约为21-25个核苷酸的非编码RNA，广泛存在于真核生物中。它们通过与靶mRNA的3'-UTR特异性结合，抑制mRNA的翻译或促进其降解，从而在转录后水平调控基因表达。这种调控方式在细胞的生长、分化、凋亡以及疾病发生发展中扮演着关键角色。然而，由于miRNA与靶mRNA的结合具有高度特异性，且结合位点往往较短，传统的实验方法难以高效、准确地验证miRNA与靶基因之间的关系。
双萤光素酶报告基因检测系统是一种高灵敏的实验技术，广泛应用于miRNA靶基因验证。该系统利用萤火虫萤光素酶（Firefly Luciferase, FLuc）和海肾萤光素酶（Renilla Luciferase, RLuc）的发光特性，通过检测两种萤光素酶的活性比值，可以排除细胞生长状况、转染效率等因素的干扰，从而准确评估实验结果。
miRNA靶基因验证实验流程
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实验材料准备
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合成miRNA模拟物（miRNA mimics）和对照（mimics NC）。
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进行miRNA靶基因验证时，传统的双萤光素酶报告基因实验需要用到两个载体，分别表达主报告基因和内参报告基因。现在可以直接采用pmirGLO载体作为报告基因载体，该载体同时包含萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶报告基因，使用更简单。验证miRNA靶基因时，直接将目标基因的3'-UTR克隆到pmirGLO载体上萤火虫萤光素酶报告基因的下游，即为pmirGLO-3'-UTR-WT。
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同时为了实验更有说服力，一般可以预测miRNA和靶基因的结合位点并对预测结合位点进行突变后同样克隆到萤光素酶报告基因的下游，即为pmirGLO-3'-UTR-MUT。
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细胞转染
材料准备好后就可以进行细胞转染。可以参考下表进行分组。一般实验选择瞬时转染即可。
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报告基因检测
一般转染48 h后，即可收集细胞并用双萤光素酶报告基因检测试剂盒进行检测。
应用案例解析
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案例一
结肠癌是全球最普遍的恶性肿瘤之一，探究其发病机制对于临床意义非凡。作者发现miR‑92a‑3p在结肠癌中高表达。为了探究miR‑92a‑3p具体作用机制，作者进行一系列预测并发现miR‑92a‑3p很可能结合EID2B并调控其下游。作者通过网站预测了miR‑92a‑3p和EID2B的结合位点并构建了EID2B-WT和EID2B-MUT。双萤光素酶报告基因检测显示miR‑92a‑3p可以结合EID2B并显著抑制其活性。本文章中使用APExBIO的Dual Luciferase Assay System（货号：K1136）进行双萤光素酶报告基因实验。
（引用自：Med Oncol. 2025 Mar 10;42(4):96.）
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案例二
肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤的发生发展中扮演重要角色。作者前期发现GRP78-exos能够促进结肠癌耐药。进一步探究时他们发现GRP78-exos共培养的结肠癌细胞中miR-769-5p显著上调并与结肠癌恶性进程密切相关。为了找到miR-769-5p的下游靶基因，作者通过网站进行预测发现MAPK1很可能是miR-769-5p靶基因。随后，作者通过双萤光素酶报告基因验证了这一点。从下图中可以看出，miR-769-5p结合MAPK1-3'-UTR-WT后明显抑制其表达，而进行突变后而无明显变化。
（引用自：Cell Death Dis. 2025 Mar 5;16(1):156.）
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