在科研圈流行一句话：

“分子结合看得清，科研路上走得轻。”

到底哪种方法适合高通量筛选？哪种能拿到动力学数据？样品量少的时候该怎么选？如果想要深入了解结合的热力学机制，又该用哪种技术？

别担心！今天这篇文章，就带你用最简单直白的方式，快速搞懂四种常见亲和力检测方法，帮你找到最适合自己项目的“秘密武器”！

无论你是小试牛刀的新手，还是希望精益求精的科研老手，这篇都值得收藏。

在分子相互作用研究中，SPR（表面等离子共振）、BLI（生物层干涉）、MST（微量热泳动）和ITC（等温滴定量热法）是目前最常用的四种亲和力检测方法。

它们各自基于不同的物理原理，适用于不同类型的样品和实验需求：

四种方法各有优势与局限，选择合适的技术平台，可以根据项目需求实现最佳的检测效果。接下来，我们将逐一深入了解这四种技术的工作原理、特点和应用场景。

工作原理：

实时记录分子结合和解离过程中传感芯片表面分子质量发生的变化，共振角 (即SPR角)就会随之发生变化，从而实时地监测分子间的相互作用。

为了研究两个分子之间的相互作用，其中一个分子被固定到芯片表面上(Ligand)，而另一个分子 (Analyte) 以溶液的形式连续流过芯片表面，检测器能实时检测溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离过程，并以SPR响应值的形式显示。

特点：

SPR的方法不仅可以检测是否有特异性的结合，还可以通过数据分析软件获得分子间的结合速率常数(association rate constant，ka)、解离速率常数(dissociation rate constant，kd)、平衡解离常数(dissociation equilibrium constant，KD)等参数。

图1 SPR检测原理

工作原理：

生物膜干涉技术 (BLI) 采用探针式生物传感器对样品直接进行检测，对检测样品无需做任何荧光或同位素标记。

通过仪器发射白光到传感器表面并收集反射光，不同频率的反射光谱受到生物传感器的光膜层厚度的影响并形成干涉。因此，结合到传感器表面的分子一旦有厚度的改变，仪器便会实时地检测到干涉光谱的位移，而这种位移可直接反应出传感器表面生物膜的厚度及密度变化，从而对待测分子间的相互作用过程进行精确的定量测定。

通过对分子结合过程的实时监测，系统会测定结合常数 (ka 或 kon) 和解离常数(kd 或 koff)，以及起始结合速率，并通过拟合计算分析得到亲和力 (KD) 和浓度信息。

应用场景：

可进行文库筛选、表位分类、肿瘤中分子标记物的筛选、浓度梯度依赖性结合分析、分子垂钓、观察蛋白复合物的组装过程、竞争性结合分析等研究。

图2 BLI检测原理

等温滴定量热法 (ITC) 是用于量化研究各种生物分子相互作用的一种技术，它可直接测量生物分子结合过程中释放或吸收的热量。

工作原理：

通过测量结合过程中的热量变化，就能够准确地确定结合常数 (KD)、反应化学量 (n)、焓 (∆H) 和熵 (ΔS)。

仪器包含一个参照池和一个样品池。参照池通常加入纯水，样品池加入待研究对象中的一种(一般为大分子，如蛋白质)，而滴定器里则装有另一种研究对象称之为配体(例如化合物)。在实验过程中，配体被可控地滴入样品池中(同时伴随充分混合)。每次滴定会产生一个热量脉冲，通过对每一次滴定时热量的积分并对浓度进行归一化处理后生成摩尔放热量 (kcal/mol) 对摩尔比率(配体/样品)作图，再选择拟合合适的结合模型 (Binding Models)，获取结合相关的亲和力 (KD)、化学结合计量比 (n)、焓变 (ΔH) 和熵变 (ΔS)。

图3 ITC检测原理

微量热泳动技术 (MST) 可以定量分析分子间相互作用 (图4A-4D)。

工作原理：

实验时对互作分子中的一个分子进行荧光标记，使之成为非常灵敏的标签分子，在 MST 技术中称之为 Target；与之互作的另一个分子称之为 Ligand。

Target 分子与 Ligand 分子结合形成复合物，复合物分子的尺寸、水化层和电荷的改变都可以导致复合物分子的热泳动速度相对于 Target 分子热泳动速度发生改变，因此很容易检测到到由 Target 与 Ligand 分子的结合引起的 MST 信号变化。

进行 MST 实验时将Ligand 分子按照2倍的浓度梯度稀释配制16管溶液，然后和 Target 分子等体积混合，吸入毛细管后放入仪器中进行检测 (图4B)。

检测时仪器中的红外激光束对毛细管的的检测区域正中心进行加热，激光束周围的溶液形成温度梯度，分子在温度梯度溶液中由高温区域向低温区域定向移动，并且移动速度和分子的尺寸大小、水化层及电荷有关 (图4C)。

激发光激发 Target 分子上的荧光基团，通过检测 Target 分子荧光基团发出的发射光的荧光强度变化，从而记录了热泳动速度的差异 (图4B，4C)。

下面D图中每一条曲线是一根毛细管中的荧光强度实时记录曲线，记录了荧光强度在温度梯度中随时间的变化。然后将荧光强度的数值做纵坐标，配体浓度做横坐标进行拟合作图，软件自动计算得到分子间结合的亲和常数 KD 值 (图4D)。

图4 MST检测原理