双荧光素酶验证转录因子与启动子互作：一种高效的基因表达分析方法

双荧光素酶验证转录因子与启动子互作：一种高效的基因表达分析方法

在分子生物学研究中，启动子是调控基因表达的关键元素。了解启动子的活性对于揭示基因调控机制、疾病发生发展以及开发新的治疗策略具有重要意义。本文将详细介绍一种高效的启动子活性检测方法——双荧光素酶报告系统，这是一种广泛应用于基因表达和调控研究的技术。双荧光素酶报告系统是一种基于两种不同荧光素酶（如火萤荧光素酶和海洋萤光素酶）的活性比较，用于同时检测两个启动子活性的方法。该系统通常包括两个报告基因：一个是实验启动子驱动的报告基因，另一个是内参启动子（如CMV启动子）驱动的报告基因，用于校正实验变异和细胞数目的差异。

一、应用领域

上期为大家介绍了荧光素酶技术的发展和原理。本期就来详细聊聊双荧光素酶在转录因子与启动子互作验证方面的应用。真核生物基因表达是一个十分复杂而有序的过程，是众多的反式因子和顺式作用元件之间相互作用的结果。基因的表达在各个层次上都受到精密的调控（包括染色体结构、转录、转录后、翻译和翻译后加工等水平的调控）。转录水平的调控发生在基因表达的初期阶段，是很多基因表达调控的主要方式之一，该过程是指一类称为转录因子的蛋白质特异地结合到靶基因调控区的顺式作用元件上，或调节基因表达的强度，或控制靶基因的时空特异性表达，或应答外界刺激和环境胁迫，最终呈现生物体不同的表征，对生命的正常发育和进化至关重要。双荧光素酶系统在这个过程中的应用步骤如下。

一、目的基因启动子序列获取及与转录因子的结合位点预测

在线网站UCSC（http://www.genome.ucsc.edu/）或NCBI（/https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）均可获取指定基因的启动子序列；

结合位点可通过在线网站JASPAR （https://jaspar.genereg.net/）进行预测。

常用增强子查询数据库：EnhancerAtlas（/http://www.enhanceratlas.org/）、dbSUPER（/https://asntech.org/dbsuper/）等。

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二、双荧光素酶验证系统相应质粒体系及分组

用于启动子活性及与转录因子结合验证的双荧光素酶报告系统：pGL3-Basic，将待分析启动子元件序列构建到F-Luciferase上游；pcDNA3.1，用于过表达待测转录因子。用于增强子/抑制子研究的双荧光素酶报告系统包括：pGL3-Promoter，将待分析增强子/抑制子序列构建到启动子上游。两个系统均需要共转pRL-TK，用于表达RLuc的内参质粒。

增强子/抑制子双荧光素酶质粒系统

利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把待研究的基因转录调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上/下游，构建成荧光素酶报告质粒，然后转染细胞，经适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。同时可转染表达R-Luciferase的内参载体pRL-TK质粒以校正不同样品之间的转染效率。

二、案例分析

SOX9 indirectly regulates CEACAM1 expression and immune resistance in melanoma cells. doi: 10.18632/oncotarget.7379.

在该文章中，研究了转录因子SOX9在黑色素瘤细胞CEACAM1表达和免疫抵抗调控中的作用。研究发现，内源性SOX9下调导致CEACAM1上调，而其过表达则导致相反的效果。通过进一步实验发现SOX9在转录水平上控制CEACAM1的表达，而且是以间接的方式发挥这一功能，因为即使所有八个潜在的SOX9结合位点都被敲除，也不会影响SOX9对CEACAM1启动子的调控作用。该研究中发现SOX9调节黑色素瘤细胞中CEACAM1的表达，有助于开发新的治疗方法。

结语

双荧光素酶报告系统是一种高效、准确的启动子活性检测方法，它不仅可以帮助科研人员深入理解基因的调控机制，还为药物开发和基因治疗提供了强有力的工具。随着生物技术的不断进步，相信这一技术将在未来的生物医学研究中发挥更大的作用。

参考文献：SOX9 indirectly regulates CEACAM1 expression and immune resistance in melanoma cells.