肝脏是负责脂质和葡萄糖代谢、蛋白质合成、胆汁分泌和免疫机能的重要器官。单细胞测序技术正在革新我们对肝脏疾病的认识，它就像是一把神奇的“解码器”，能够破解肝脏中每个细胞的基因表达信息，揭示它们在健康和疾病状态下的秘密对话。通过这项技术，我们不仅能探索肝脏的发育图谱和运作机制，还能为脂肪肝、肝炎、肝硬化、酒精肝甚至肝癌等疾病量身定制更精准的治疗方案。请随小编一起探索单细胞测序如何解密肝脏免疫微环境和不同肝脏疾病的发生机制！
肝脏的结构
肝结构的基本单位是肝小叶，肝小叶以中央静脉为中心，肝板、肝血窦围绕中央静脉呈辐射状分布。肝脏的右叶和左叶在解剖结构上由肝中静脉分隔，功能上相对独立，右叶在体积和代谢负荷上通常大于左叶。在脂肪肝中，右叶可能更容易积累脂肪，但具体情况因个体而异。
图1 肝脏的构成
肝脏中细胞分布
肝脏的细胞组成主要包括肝实质细胞（即肝细胞），根据在肝小叶中的位置不同分为Periportal hepatocytes（门静脉周围肝细胞），Pericentral hepatocytes（中央周围肝细胞）；非实质细胞：包括Endothelial cell (EC)-内皮细胞，Hepatic stellate cell (HSC)-肝星状细胞，Cholangiocyte-胆管细胞，Fibroblast- 成纤维细胞，Mesothelial cell (Meso)-间皮细胞，Megakaryocyte-巨核细胞，免疫细胞（T细胞，自然杀伤细胞，B细胞，树突状细胞，单核细胞，巨噬细胞，库普弗细胞，中性粒细胞，嗜碱性粒细胞，粒细胞-单核细胞祖细胞，造血祖细胞）。
图2 肝脏在不同发育阶段的细胞类型汇总
由于肝实质细胞比较脆弱，其直径通常在20-30微米范围，容易在肝组织解离中损失，通常采用提取肝脏核以在单细胞图谱构建中获取更多的肝实质细胞信息。除了肝实质细胞，免疫细胞的获取通常也因前处理（组织提核或解离）的不同而有所差异。如图3所示，其中单细胞转录组获取的免疫细胞数明显高于单细胞核转录组。
图3 使用单细胞转录组和单细胞核转录组对肝脏不同细胞比例对比
那肝脏疾病类型研究是选择单细胞核转录组还是单细胞转录组？如果关注肝实质细胞，建议选择单细胞核转录组。对于脂肪肝这类特殊样本，因细胞内含较高脂质导致细胞膜更脆弱，在解离过程细胞更容易破裂，若无明确关注的细胞类型也可选择单细胞核转录组。下表展示了肝脏样本分别做单细胞转录组或单细胞核转录组的优劣势：
如果关注免疫细胞，则选择单细胞转录组，且可使用CD45抗体做磁珠或流式的免疫细胞分选。下表展示了酒精肝中的免疫细胞类型，功能等信息：
肝脏单细胞转录组相关文献摘录
激活库普弗细胞中的GPR3-β-arrestin2-PKM2通路可刺激糖酵解，抑制肥胖和肝脏病理发生
Activation of GPR3-β-arrestin2-PKM2 pathway in Kupffer cells stimulates glycolysis and inhibits obesity and liver pathogenesis
期刊：Nature Communication 影响因子：14.74
实验方案
细胞因子检测，共免疫沉淀实验，WB，代谢物检测，免疫荧光实验，Myc荧光素酶报告基因检测，基因敲除构建，小鼠模型建立，转录组，单细胞转录组。
单细胞样本信息
3例健康人和3例非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）受试者PBMC，使用流式分选CD45+细胞。
研究背景
NAFLD是一种以肝脏脂肪沉积为特征的常见肝病，其发病与肥胖和糖尿病密切相关，并可能进展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化甚至肝癌。库普弗细胞（Kupffer cells，肝脏驻留巨噬细胞）在NAFLD的发病机制中起关键作用，但其具体机制尚不清楚。G蛋白偶联受体3（GPR3）是一种与代谢过程相关的受体，其在巨噬细胞中的作用尚未充分研究。
研究目的
探讨GPR3在KCs中的激活如何通过代谢重编程影响NAFLD的发病机制，特别是通过GPR3-β-arrestin2-PKM2通路调控糖酵解，从而抑制肥胖和肝脏病理的过程。
研究结果
单细胞RNA测序分析显示：在NAFLD患者的肝脏中存在疾病相关巨噬细胞（DAMs），它们的表型与非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和肝硬化患者肝脏中的DAMs相同，包括表达TREM2、CD9、GPNMB、MHCII（HLA-DRB1）、C1QA和CLEC10A。在转录水平上，DAMs表现出糖酵解基因的下调和炎症基因的上调，提示其糖酵解功能受到抑制，而炎症反应增强。重要的是，NAFLD患者的库普弗细胞（包括DAMs）对DPI（二苯乙烯碘化物）的反应是通过上调糖酵解基因的转录和下调炎症基因的转录来实现的，这表明DPI在重编程人类库普弗细胞的代谢方面也具有有效性。
Single Cell RNAseq Analysis of Renalase and ATP2B4 expression in Liver Pathology and Tissue Injury
单细胞RNA测序分析Renalase和ATP2B4在肝脏病理及组织损伤中的表达
期刊：The American Journal of Gastroenterology
影响因子：10.231
实验方案
单细胞转录组测序。
单细胞样本信息
51例人肝纤维化患者肝脏组织：包括非酒精性脂肪性肝炎（NASH），酒精性肝硬化，肝细胞癌（HCC），原发性胆汁性胆管炎（PBC），和健康对照组。在小鼠实验中，小鼠分别接受CCl₄处理（n = 3）或高脂饮食（n = 3）诱导肝纤维化。
研究背景
肝脏疾病（如肝纤维化、肝细胞癌和非酒精性脂肪性肝炎）的发病机制复杂，涉及多种细胞类型和分子通路的改变。RNLS和ATP2B4的表达模式及其在细胞保护和疾病进展中的作用尚不清楚。其中Renalase（RNLS）：一种胺氧化酶，其表达与免疫微环境的调节有关。ATP2B4（PMCA4b）：一种钙离子泵，调节细胞内钙水平，对多种细胞过程至关重要。近期研究发现ATP2B4是RNLS的细胞外受体，介导细胞信号传导和细胞保护。
研究目的
本研究旨在通过单细胞RNA测序分析RNLS和ATP2B4在肝脏病理和组织损伤中的表达模式，揭示其在肝纤维化、肝细胞癌（HCC）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）中的潜在作用。
研究结果
单细胞测序发现在人类肝细胞癌（HCC）和酒精性肝硬化患者的肝细胞中，RNLS表达显著增加（P < 0.000）。在NASH患者的上皮细胞中，RNLS表达也显著增加（P = 0.011）。在NASH、酒精性肝硬化和原发性胆汁性胆管炎患者的髓系细胞中，RNLS表达显著增加（P = 0.000, 0.013, 0.001）。在诱导肝纤维化的鼠模型中，肝细胞的RNLS表达同样显著增加（P = 0.002）。ATP2B4表达也增加：在肝硬化和HCC患者的基质细胞中，ATP2B4表达显著增加（P < 0.000）。在酒精性肝硬化和原发性胆汁性胆管炎患者的肝细胞中，ATP2B4表达显著增加（P = 0.000, 0.042）。RNLS和ATP2B4的表达增加可能与细胞保护机制相关，尤其是在HCC和NASH中。RNLS通过与ATP2B4结合可能在细胞存活中发挥重要作用，尤其是在纤维化肝脏损伤中。
参考文献
Liang Y, Kaneko K, Xin B, et al. Temporal analyses of postnatal liver development and maturation by single-cell transcriptomics. Dev Cell. 2022;57(3):398-414.e5. doi:10.1016/j.devcel.2022.01.004
Andrews TS, Atif J, Liu JC, et al. Single-Cell, Single-Nucleus, and Spatial RNA Sequencing of the Human Liver Identifies Cholangiocyte and Mesenchymal Heterogeneity. Hepatol Commun. 2022;6(4):821-840. doi:10.1002/hep4.1854
Wang X, Wang J, Peng H, Zuo L, Wang H. Role of immune cell interactions in alcohol-associated liver diseases. Liver Res. 2024;8(2):72-82. Published 2024 Jun 10. doi:10.1016/j.livres.2024.06.002
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