技术分享|细胞污染预防与应对方案
技术分享|细胞污染预防与应对方案
细胞培养几乎是每个生物人的入门实验。培养细胞可以算简单，因为培养步骤并不复杂；但是又不简单，因为在培养过程中可能会遇到各种问题，一不小心，辛辛苦苦培养的细胞就挂掉了。轻则耽误实验的进度，重则可能会影响毕业的时间（说多了都是泪）。
细胞污染是细胞培养中最常遇到的问题。细胞污染可以分为物理污染、化学污染和微生物污染。目前我们常说的一般都是指微生物污染。下面我们将给大家介绍最常见的微生物污染类型。
一、细菌污染
细菌是细胞培养中最常见的污染源，常见的细菌污染为大肠杆菌和葡萄球菌污染。细菌污染主要来源于环境、操作人员（未正确穿戴实验服和手套）和操作手法（没有严格无菌）。
细菌污染特点
- 肉眼可以观察到培养基发黄、浑浊，培养皿中有细沙状沉淀。
- 显微镜下可以观察到细菌的定向运动。
- 可能会有异样气味。
图1：细胞污染常见现象
（图源自网络）
日常预防
日常可以使用抗生素（如青霉素-链霉素双抗、庆大霉素）预防细菌污染。
污染应对
可以先用PBS多次清洗细胞（稀释细菌），然后尝试使用高浓度的抗生素（如10倍浓度以内的双抗）冲击细胞，24-48 h后再换成常规抗生素浓度。
二、真菌污染
真菌污染是另一种常见的细胞污染，常见的真菌污染为霉菌、念珠菌和酵母菌污染。由于真菌可以通过孢子繁殖，极易扩散，所以一旦出现真菌污染，很难杀灭。
真菌污染特点
- 霉菌污染的培养基短期内仍为清亮透明的，不会浑浊。但是长期以后培养基表面或细胞上会出现白色、黄色或黑色的点状、丝状、管桩或树枝状结构。
- 念珠菌和酵母菌一般是卵圆形出现在细胞周边。
- 酵母菌污染会让培养基浑浊。同时其出芽生殖时有明显的一大一小连体结构。
图2：常见真菌污染类型
（图源自网络）
日常预防
日常培养细胞时可以加入抗真菌剂（两性霉素、制霉菌素和氟康唑等）。
污染应对
真菌污染是极其难以杀灭的，但是如果细胞极为珍贵，可以尝试先用PBS多次洗涤细胞，然后使用较高浓度的两性霉素（25 µg/mL）处理12-24 h，随后使用低浓度两性霉素（如3-5 µg/mL）继续培养，直到传代的细胞恢复正常。
三、支原体污染
支原体是一种无细胞壁的细菌，因其体积小（0.1-0.3 μm），不易被发现，是细胞培养中一种隐蔽的污染源。目前支原体污染的比例也越来越高。
支原体污染特点
- 可透过滤膜（0.22~0.45 μm）。
- 肉眼/光学显微镜不可见，必须通过检测。
- 轻度污染不影响细胞生长速率。
- 改变细胞的DNA/RNA/蛋白合成。
- 无细胞壁，许多抗生素无效。
图3：通过DNA荧光染色后可以看到细胞周围“拉丝”的支原体
（图源自网络）
日常预防
可以在培养细胞时加入低浓度的支原体预防与清除试剂（如Mycoplasma Remover Reagent或Mycoplasma Remover Reagent Plus）预防支原体污染。
污染检测
因为支原体肉眼或者显微镜都难以发现，一定要通过检查才可以确认。所以可以通过DNA荧光染料(如DAPI、Hoechst 33342和Hoechst 33258)对细胞进行染色，随后使用荧光显微镜观察支原体污染情况（如图3所示）。
虽然DNA荧光染色简单快捷，但是其灵敏度有限。PCR检测（PCR Mycoplasma Detection Kit）是一种比DNA荧光染色灵敏度高很多的方法，同时其检测也比较简单，数小时即可完成检测。
污染应对
一旦确定细胞出现支原体污染，可以尝试用支原体清除试剂（如BM-Cyclin、Mycoplasma Remover Reagent或Mycoplasma Remover Reagent Plus）对支原体进行清除，一般2-3周可以看到明显的支原体清除效果。
结语
以上简单介绍了常见细胞污染以及出现污染时的应对方法。但是需要明确的是一点是，一旦出现细胞污染，想要完全去除是非常困难的。所以对于易于获得或有备份的细胞，建议直接丢弃污染细胞。只有当细胞非常珍贵时，可以考虑用以上方法进行挽救。
其次，俗话说“事后补救不如事前预防”，平时培养细胞时一定要时刻注意以下事项：
A. 无菌操作
- 进入培养间一定穿培养间专用实验服，长发建议扎起或者戴帽子，佩戴口罩和手套，避免引入人体的污染。
- 细胞实验用品需要高压蒸汽灭菌并放入培养间烘箱烘干。
- 超净台操作前双手和实验用品都需要75%酒精消毒，超净台内物品需要合理摆放，操作时需要时刻保持无菌意识，手不要从暴露的瓶口上过，操作后及时盖上瓶盖。
- 超净台使用后需要75%酒精擦拭台面。
B. 培养间清洁
定期对培养间和仪器进行消毒杀菌（如甲醛熏蒸）
- 细胞培养箱可以定期用75%酒精和新洁尔灭消毒，水盘内的灭菌水（可加入硫酸铜）且每周更换。硫酸铜是一种性价比高的预防真菌试剂，但是缺点是有腐蚀性。
- 水浴锅的无菌水（可加入硫酸铜）也需要定期更换。
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