基于mRNA的治疗手段目前正应用于各种疾病，其中使用mRNA进行脾靶向递送，调节免疫反应，对于自身免疫性疾病如类风湿性关节炎(RA)是一种有潜力的治疗策略。然而，对于靶向脾脏内的免疫细胞，特别是B细胞，进行有效的免疫调节仍然具有挑战。近日浙江大学团队在Advanced Functional Materials杂志发表的题为Spleen-Targeted mRNA Nanoparticles for Modulating B Cell Hyperactivation in Rheumatoid Arthritis Therapy的研究论文。该研究作者设计了一种脂质聚合物纳米颗粒（LPNs）递送系统，能够将FcγRIIB mRNA特异性地递送到脾脏内B细胞，从而抑制B细胞引起的过度免疫激活，改善RA小鼠症状。该研究为调节B细胞活性和减轻自身免疫性疾病提供了一种精确和有针对性的方法。其中研究论文用到的FcγRIIB mRNA由APExBIO定制合成。

LPN的脾脏靶向转染

作者首先经过系列筛选优化实验，最终确定使用AMB-POC18脂质和PEG-PLA合成出低毒，转染效果良好的纳米颗粒LPN。接下来为了评估LPN脾靶向的转染效率，将荧光素酶mRNA（mLuc）装载入LPN内制备PEG2k-PLAx mLuc/LPNs。IVIS活体成像显示，荧光素酶主要在脾脏中表达（图1a）。而且在所有配方中，使用PEG2k-PLA2k mLuc/LPNs递送在脾脏中表达最为良好（图1b）。

纳米颗粒在体内血液循环中，表面会吸附各种血清蛋白，从而会改变其表面性质，影响其生物分布和细胞摄取。为了解释LPN的脾B细胞靶向机制，作者通过质谱蛋白质组学来识别与LPN结合的血浆蛋白（图1e）。结果显示LPNs和脂质纳米颗粒(LNPs)存在类似的蛋白吸附谱（图1g），并发现补体C3蛋白是LPNs和LNPs蛋白吸附谱中的优势蛋白（图1h）。根据报道，补体C3与能与B细胞的补体受体2结合，这种相互作用可能有利于引导LPN进入脾脏B细胞内，为验证补体C3参与脾特异性mRNA递送，作者在给予小鼠LPN之前先使用眼镜蛇毒液因子（CVF）处理小鼠，用于消耗血清补体C3活性。结果与未处理组相比，CVF处理后小鼠的脾脏中荧光素酶的表达显著减少（图1i-j），这也直接支持了补体C3蛋白对于LPN的脾B细胞靶向的关键作用。

图1 脾脏特异性靶向LPN

FcγRIIB的免疫抑制功能

FcγRIIB是维持免疫稳态的重要抑制性Fc受体，通过增强脾脏B细胞内FcγRIIB的表达，从而减弱免疫过度激活是很有前途的RA治疗策略。基于此理论，作者将FcγRIIB mRNA (mFcγRIIB)装载在LPN内进行体内外转染验证，探究FcγRIIB的功能作用。体外实验的流式细胞证实LPN转染DC2.4细胞或Raw 264.7细胞后，FcγRIIB表达水平均显著增加(图2a-d)，表明LPN可以有效将mRNA递送到不同类型的免疫细胞内。而随后进行的体内转染实验，也同样显示给予mFcγRIIB/LPNs可导致小鼠脾细胞中FcγRIIB的表达显著增加 (图2e-f)，而且主要是脾脏内的B细胞和巨噬细胞亚群(图2g)。

FcγRIIB能够与IgG组成免疫复合物，与Bcell受体作用，从而诱导B细胞凋亡，这一机制有利于消除反应性B细胞，避免自身免疫反应。作者使用表达膜结合IgG的小鼠B淋巴瘤A20细胞检测FcγRIIB的这种B消除作用。结果显示A20细胞转染mFcγRIIB/LPNs后，FcγRIIB的表达显著增加(图3h-i)。用小鼠IgG1和免疫球蛋白共同刺激转染细胞，给予不含mFcγRIIB的AMB-POC18类脂质和PEG2k-PLA2k复合物或mLuc/LPN处理均未能诱导细胞凋亡，而给予mFcγRIIB/LPNs则能使A20细胞凋亡显著增加(图2j)。综上，这些结果表明，mFcγRIIB/LPNs能靶向转染到脾B细胞中，并能选择性消除自身反应性B细胞，这样的结果对于RA模型治疗非常理想。

图2 mFcγRIIB/LPNs的体外内转染

mFcγRIIB/LPNs对RA的治疗

基于上述结果，作者接着使用胶原诱导关节炎（CIA）小鼠模型验证mFcγRIIB/LPN的对于RA的治疗效果。将CIA小鼠随机分成3组，分别给予PBS、mFcγRIIB/LPN或RA治疗药物甲氨蝶呤（MTX）。CIA评分可以看出，与PBS组相比，LPN和MTX治疗均能缓解疾病症状，并且LPN相比MTX组疗效更为显著(图3b)。组织学和形态学分析也进一步佐证LPN处理组能明显改善关节损伤(图3e-g)。此外，关节的micro-CT分析显示，与骨侵蚀严重的PBS组和MTX组相比，LPN处理组的骨表面更光滑，骨密度更高（图3h），能有效改善骨密度BMD、骨体积与总体积比BV/TV 、骨小梁Tb等骨微结构(图 3i-m)。总之，mFcγRIIB/LPN能够在CIA模型中阻止骨损伤的进展并促进骨修复，在预防RA的长期关节损伤方面具有强大潜力。

图3 mFcγRIIB/LPN对类风湿关节炎的体内疗效

LPNs通过调节脾B细胞的功能改善RA症状

最后，为阐明LPNs治疗RA的潜在机制，作者分析了mFcγRIIB在不同脾细胞群中的表达。结果显示LPNs处理显著上调关键免疫细胞上FcγRIIB的表达，包括B细胞、浆细胞、巨噬细胞和树突状细胞（图4a-d）。这些免疫细胞特别是B细胞内FcγRIIB的大幅上调对抑制RA过度激活的免疫反应相当重要。此外，LPN治疗还能对脾脏免疫微环境进行调节，如M2/M1巨噬细胞比例显著增加，CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的数量减少等（图4e-g），表明免疫细胞向抗炎表型转变，利于恢复免疫系统稳态。

图4 RA小鼠给予治疗后脾脏内免疫细胞亚群的流式细胞仪分析

FcγRIIB对B细胞的抑制作用涉及一系列细胞信号通路，包括激活关键酶Lyn、肌醇磷酸酶（SHIP-1）等，抑制关键下游信号分子CD19，从而减弱B细胞的激活和过度免疫反应。WB结果显示与PBS和MTX组相比，LPN处理的小鼠脾脏中FcγRIIB、SHP-1和Lyn如预期上调，并且CD19磷酸化水平明显降低（图5a-h）。另外，B细胞的Ca2+水平下降也是其活化被抑制的一个重要指标，对分选的B细胞进行流式细胞术分析显示mFcγRIIB/LPNs处理后的细胞内钙(Ca2+)水平显著降低(图5I-j)。综合上述结果可以得出结论，LPN处理通过干预FcγRIIB/Lyn/SHP-1信号通路，从而抑制B细胞的活化(图5k)，进而恢复免疫稳态，降低RA的严重程度。

图5 LPNs过表达FcγRIIB能抑制RA小鼠中脾B细胞的过度活化

结论

本文作者开发了一种新型脾靶向mRNA递送系统LPN，其对脾脏的特异性靶向主要归因于表面选择性吸附血清中的补体C3蛋白。通过利用该LPN靶向脾脏递送FcγRIIB mRNA，可以有效诱导脾脏B细胞中FcγRIIB的过表达，调节FcγRIIB/Lyn/SHP-1信号通路而抑制B细胞过度活化，从而对RA产生显著治疗效果，为治疗以B细胞过度活化为特征的自身免疫性疾病提供有潜力的治疗方案。