转录因子靶基因关系验证的双荧光素酶实验详解

转录因子靶基因关系验证的双荧光素酶实验详解

双荧光素酶实验是科研工作者们经常会用到的工具，尤其是在表观组学和转录因子备受关注的今天，因为它可以用来验证转录因子及其靶基因的关系。那该实验是如何操作的呢？

除了上述的应用方向外，它是否还能解决其它问题呢？今天，我们就来聊聊这个话题。

一、实验原理

所谓知己知彼百战不殆，那我们先来看看双荧光素酶实验的定义。荧光素酶可以催化荧光素氧化成氧化荧光素，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光。目前应用最多的是从甲虫中分离得到的发黄绿光的萤火虫荧光素酶（firefly luciferase）和从海肾中分离得到的发蓝光的海肾荧光素酶（renilla luciferase）。“双荧光素酶”顾名思义就是有两种荧光在发挥作用，正是使用的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。如此所构成的报告系统有检测灵敏度高、动态范围广、应用灵活等优势。

在该系统中，萤火虫荧光素酶作为基因表达的报告基因，而海肾荧光素酶作为内参基因。这样将目的基因转录调控原件构建入带有荧光素酶(Firefly luciferase)的表达载体，构建成报告基因质粒，使这段序列调控luciferase的转录表达。然后将报告基因质粒转染细胞，给予其不同的处理后裂解细胞，并加入底物荧光素(luciferin)，luciferase可催化luciferin发出荧光(最强波长在560nm左右)。检测得到的荧光值高低可以判断不同处理组对该转录调控原件的影响。为避免由于质粒转染细胞时效率差异所造成的误差，通常会转入Renilla luciferase的报告基因质粒作为内参(最强波长在465nm左右)，目的是校正不同样本之间的转染效率，这就是双荧光素酶报告系统。

二、实验应用

我们最熟悉的应用就是miRNA靶基因验证，转录因子靶基因结合关系验证等，下面我们主要介绍这两种应用。

1. miRNA靶基因验证

实验背景：对于miRNA和靶基因的关系我们已经比较清晰：

（1）miRNA可以下调靶基因的表达；

（2）通常认为miRNA通过与靶基因3’UTR区的结合实现对靶基因表达的下调。根据以上两点我们可以通过专门的生信分析来预测出miRNA的靶基因，然后做靶基因验证。靶基因验证的金标准实验就是双荧光素酶实验。

原理：将预测能够与miRNA结合的靶基因3’UTR序列插入载体中萤火虫荧光蛋白（Firefly luciferase）的3’UTR。当我们感兴趣的miRNA和质粒中的插入序列结合后，miRNA会通过和所插入的序列结合从而抑制萤火虫荧光蛋白的翻译最终造成荧光值的下降。海肾素荧光蛋白（Renilla luciferase）作为内参来去除组间的转染效率差异。

实验设计：通过实验原理我们知道对于miRNA靶基因验证一般分为四组：

（1）对于mimic分别加到野生型（WT）和突变型（MT）是实验组；

（2）对于mimic NC同样也加到野生型（WT）和突变型（MT）中。

以上分组中野生型靶基因3’UTR野生型质粒和突变型（MT）分别与miRNA质粒共转，是体系中的目的实验组；3’UTR突变型质粒和突变型（MT）分别与miRNA对照质粒共转。

另外有些老师还会多设置一些分组，比如6分组，8分组等，这些与4分组一样，在文章中都是认可的。

结果判断：我们知道以上分组中只有miRNA和3’UTR野生型才可能存在理论上的结合位点，导致实验结果数值降低。而其它组理论上是不存在结合位点，实验结果应该是近似的。所以实验数值相对其它组高，其它组数值比较接近是比较理想的阳性结果。

2. 转录因子调控验证

转录因子指的是某基因表达出的蛋白，其可以通过结合下游基因启动子区的结合位点，来调控下游基因的转录（增强或者抑制下游基因的转录），一般我们研究中涉及到转录激活比较多。研究该转录因子是否可以和下游基因的启动子结合从而调控下游基因的转录？我们就可以诶通过双荧光素酶系统来验证。在了解了双荧光素酶在miRNA靶基因验证中的应用后，转录因子调控验证实验就不难理解了。在实验设置和结果评判上比较一致，我们就不在赘述。简单来说，就是使用双荧光素酶的发光强度来模拟下游基因的表达，荧光变强说明启动子活力变强，说明实验阳性。

如果我们除了想知道是否有结合，我们还想进一步确定结合位点的大约位置，我们还可以对下游基因的启动子区域进行截断构建不同长度的载体，或者对预测的结合位点进行突变后再进行双荧光素酶实验的检测。

三、实验操作

如果小伙伴们想独立完成该实验，我们有一款试剂盒K1136，可以协助您快速完成；如果您对此类实验不熟悉，那您还可以将需要验证的具体miRNA信息和靶基因信息或者具体启动子基因的ID和转录因子ID等信息提供给我们，我们可以设计方案并进行实验，给您提供实验数据和处理结果。

四、常见问题

在实验过程中，尤其是初次实验时，经常会遇到各种问题。在这里，我们附上几个最常见问题的解答供大家参考。

问题1

为什么要用荧光素酶实验来做检测，不用其他报告基因来做，GFP可以吗？

采用荧光素酶来做实验是由其自身的优势所决定的：

（1）蛋白不需要翻译后加工，所以一旦翻译立即产生报告活性；

（2）在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效率，因而非常灵敏。另外，在宿主细胞及检测试剂中均检测不到背景发光；

（3）检测快速，每个样品只需几秒钟。

以上优势使其成为广大科研工作者做相关验证实验的首选，其他报告基因由于种种缺陷一般不作为研究手段。

问题2

双荧光素酶实验为什么要加底物（luciferin）？

因为我们构建的双荧光素酶系统是催化酶，要发光需要底物，催化酶催化底物才能产生荧光。

问题3

为什么要用两个荧光素酶，海肾荧光素酶的作用是什么？

利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（Firefly luciferase）的上游，构建成荧光素酶报告质粒。同时，为了减少内在的变化因素（如：培养细胞的数目和活力的差别，细胞转染和裂解的效率等）对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶（Rinilla luciferase)基因作为对照与报告基因共转染细胞，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。

问题4

双荧光素酶的最终数值怎么处理？

通常比较双荧光素酶各组的数值，是需要对萤火虫荧光检测的数值和海肾荧光进行归一化反应，归一化反应的计算数值为两者的比值。