缺血性疾病是全球发病率和死亡率的主要原因，对人类健康构成重大威胁。细胞外囊泡（EVs）在促进缺血组织中的新血管形成中起着至关重要的作用，从而促进组织修复和再生。然而，EVs的使用受到其被单核吞噬细胞系统（MPS）快速摄取和清除的阻碍，这极大地妨碍了它们的治疗效果和器官特异性积累。为了解决这一问题，近日苏州大学苏州医学院附属第一医院心血管外科及心血管科学研究所的研究团队在《Journal of Nanobiotechnology》（IF=10.6）上发表题为“An integrated "Engage & Evasion" approach for mononuclear phagocyte system escape and efficient extracellular vesicle therapy”的突破性研究文章，开发了一种“Engage & Evasion”（参与与逃避）的双重策略，旨在减少EVs被肝脏和脾脏的MPS捕获，可以增强EVs的治疗潜力，改善其系统分布，从而对抗缺血挑战。APExBIO团队为本文的实验研究提供了高品质的二抗产品：HyperFluor™ 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody (Cat. No：K1206)

Scheme 1 “Engage & Evasion”方法在缺血性疾病的作用概述

研究背景

缺血性疾病是导致全球健康问题和死亡的主要原因之一，对全球健康系统构成重大挑战。由于EVs在细胞间通信中的专业性，它们被认为是一种有前景的治疗手段。EVs携带来自其源细胞的独特蛋白质和核酸酸，对缺血区域新血管的形成至关重要，有助于组织愈合和再生过程。EVs的治疗应用面临挑战，尤其是它们在血液中的快速清除。这种清除主要由肝脏和脾脏中的MPS负责，这对有效的治疗传递构成了重大障碍。

CD47是一种关键的膜蛋白，通过与信号调节蛋白α（SIRPα）结合，向巨噬细胞发送“不要吃我”的信号，避免被吞噬。在细胞或纳米颗粒表面修饰CD47已被证明可以延长药物的循环时间。尽管采用了CD47过表达的生物模拟方法在细胞膜上创建“隐形”涂层以逃避MPS检测，但仍有一部分纳米颗粒由于在生理环境中的广泛相互作用而被快速清除。因此，迫切需要更强大的干预措施来对抗MPS清除。

研究者们开发了一种创新的“Engage & Evasion”策略，旨在减EVs被MPS捕获，提高其在非MPS器官中的积累，从而增强EVs的治疗潜力和效果。

研究工作

1.设计EVs的特征和鉴定：

探究不同来源细胞外囊泡（EV）的特性，特别是CD47的表达情况，以确定其是否符合后续实验要求，使用流式细胞仪检测CD47的表达，并通过透射电子显微镜（TEM）和纳米粒子跟踪分析（NTA）观察EVs的形态和大小分布。结果发现成功生成了过表达CD47的MSC系，所有EVs显示出一致的形态、大小和表面特性。

Fig 1 设计的EVs对应的特征和鉴定

2.EV表面CD47和常见标志物的表达：

为检测不同EV表面CD47、CD81和CD9等标志物的表达，明确其生物学特征差异，使用ExoView 200平台进行生物特性分析，通过抗体芯片捕获EVs，并用流式细胞仪进行表达量分析。结果发现所有EVs中CD81和CD9的表达一致，MV⁴⁷组中CD47的表达量最高，而DV组中最低，显示了EVs的不同表达特征。

Fig 2 EV表面的CD47和常见markers的表达情况

3.巨噬细胞对DV和MV⁴⁷的摄取差异：

为比较巨噬细胞对DV和MV⁴⁷的摄取效率，以验证其在免疫逃逸方面的差异。将DV和MV⁴⁷用DiD标记后与RAW264.7巨噬细胞共培养，通过免疫荧光和流式细胞仪分析内化情况。结果发现DV被巨噬细胞内化的比例远高于MV⁴⁷，表明CD47的高表达有助于EVs逃避巨噬细胞的吞噬。

Fig 3巨噬细胞对DV和MV⁴⁷的差异摄取

4.治疗性MV⁴⁷的体内生物分布：

为验证“Engage & Evasion”策略对减少EVs被MPS捕获的效果及其在体内的生物分布。通过尾静脉注射DiR标记的MV⁴⁷，并在给予DV预处理后进行活体成像。结果发现预处理DV显著减弱了肝脏和脾脏中的DiR信号，表明“Engage & Evasion”策略有效抑制了MPS的吞噬作用，并增强了治疗EVs在特定器官的传递。

Fig 4 治疗性MV⁴⁷的体内生物分布

5.“Engage & Evasion”策略减轻心肌梗死后心脏重塑：

为探究“Engage & Evasion”策略在心肌梗死（MI）模型中的治疗效果，评估其对心脏功能和结构的影响。通过永久性结扎左前降支动脉建立小鼠心肌梗死模型，随后给予特定EVs，并在指定时间点评估心脏功能和病理变化。结果发现DV预处理组显示出左室射血分数和缩短分数的显著增加，表明“Engage & Evasion”策略不仅减轻了心脏功能障碍，还促进了心脏修复后的新生血管形成。

Fig 5 通过“参与与逃避”方法缓解心肌梗死后心脏重塑

6.“Engage & Evasion”策略促进缺血后肢恢复：

为评估“Engage & Evasion”策略对缺血后肢的治疗效果，包括血流灌注恢复和肌肉组织修复。使用小鼠后肢缺血模型，给予MV⁴⁷治疗，并在21天后评估血液流动和组织学变化。结果表明MV⁴⁷治疗显著促进了后肢血液灌注的恢复，特别是经过DV预处理后，减少了免疫细胞浸润和间质纤维化，并增加了新生血管形成。

Fig 6 使用“参与与逃避”方法加速后肢缺血的恢复

7.“Engage & Evasion”策略通过减少MPS摄取增强内皮细胞功能：

为探究“Engage & Evasion”策略增强内皮细胞功能的机制，特别是通过减少MPS摄取来实现。在体外模型中，首先用DV处理RAW264.7巨噬细胞，随后引入治疗性MV⁴⁷，并评估对HUVECs的影响。结果表明该策略通过减少MPS诱导的吞噬作用，有效增强了治疗MV⁴⁷在HUVECs中的保留和促血管生成能力。

Fig 7 “参与与逃避”策略通过MPS逃避提升内皮促血管生成功效

8.“Engage & Evasion”策略的体内安全性评估：

为评价“Engage & Evasion”策略在体内应用的安全性，包括对肝肾功能和主要器官组织学结构的影响。通过监测血清中肝肾功能指标和对重要器官进行组织学检查来评估安全性。结果发现该策略未引起肝肾毒性，且对组织结构和细胞形态没有影响，表明其具有高度的生物相容性和非毒性，适合作为临床治疗的安全选项。

Fig 8 体内安全性评估

研究结论

研究结论表明，通过实施“Engage & Evasion”策略，可以有效减少外泌体（EVs）被单核吞噬细胞系统（MPS）的清除，增强EVs在非MPS器官的积累，从而提高EVs在治疗缺血性疾病中的潜力。这种策略不仅在心肌梗死模型中显著提高了心脏功能，促进了心脏修复后的新生血管形成，而且在缺血后肢模型中也显著促进了血液灌注的恢复和新生血管的形成。此外，该策略在体外模型中通过限制髓系细胞的摄取，增强了治疗性EVs在内皮细胞中的保留和促血管生成能力。经过安全性评估，该策略显示出良好的生物相容性和非毒性，没有引起肝肾毒性，且对组织结构和细胞形态没有影响，为缺血性疾病的EVs治疗提供了一个有前景的途径，并强调了其作为安全治疗选项的潜力。

文章精彩看点

创新的“Engage & Evasion”策略：文章提出了一种新颖的双重策略，通过调节EVs与MPS的相互作用来提高治疗效果，这是该研究的一大亮点。

CD47的免疫调节功能：利用CD47的“不要吃我”信号来延长EVs的循环时间，为EVs的治疗应用提供了新的思路。

多方面的实验验证：从体外细胞实验到体内动物模型，研究提供了全面的实验验证，增强了结论的可靠性。

生物安全性的全面评估：研究不仅关注疗效，还对策略的生物安全性进行了全面评估，这对于临床转化尤为重要。

不足支持（文中）

分子机制的深入研究：虽然提出了CD47在逃避MPS中的作用，但具体的分子机制和信号通路需要进一步研究。

长期效果和安全性：研究主要关注短期内的治疗效果，长期应用的安全性和效果尚未评估。

临床应用的验证：研究在动物模型中进行，其在人类疾病治疗中的适用性和效果需要进一步的临床研究来验证。

后续可展开角度

分子机制的深入探索：探索CD47逃避MPS的具体分子机制和信号通路，以深化对这一过程的理解。

长期效果和安全性研究：评估“Engage & Evasion”策略长期应用的安全性和治疗效果，为临床应用提供更多数据支持。

临床试验：开展临床试验，验证该策略在人类疾病治疗中的有效性和适用性，推动其向临床治疗的转化。

药物载荷优化：研究如何优化EVs的药物载荷，以提高治疗效果和减少副作用，增加治疗的针对性和效率。

跨学科合作：鼓励跨学科的研究合作，以促进不同领域知识与技术的交叉融合，发现新的研究视角，解决复杂问题。

参考文献

[1] Liu H, Li M, Xiang B, Yang Z, Cao S, Gong W, Li J, Zhou W, Ding L, Tang Q, Wang S, Tang J, Fan Z, He K, Jiang X, Shen Z, Chen W, Hui J. An integrated "Engage & Evasion" approach for mononuclear phagocyte system escape and efficient extracellular vesicle therapy. J Nanobiotechnology. 2024 Dec 19;22(1):770. doi: 10.1186/s12951-024-03032-z. PMID: 39696354; PMCID: PMC11658260.