ELISA体系组分解读

酶联免疫吸附测定（ELISA）的关键构成要素包括固相载体、吸附剂（各类目标生物分子）、以及在测定流程里所运用的洗涤与封闭试剂、酶及底物等。本文将对各个组分进行深入介绍。

固相Solid Phase

市面上有多种形式和支撑材料的 ELISA 载体，常见的平台包括微量滴定板（Microtiter well plates）、小球（Small balls）和小试管（Small tubes）。其中，微量滴定板通常被设计成96、384等孔板的形式，可同时分析大量样本。聚苯乙烯（PS）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）和聚碳酸酯（PC）等是常见的孔板材料。特别是聚苯乙烯，它是一种具有成本效益、高度透明且相对亲水的材料，非常适合蛋白质吸附，可以通过模塑技术制造出各种形状的多孔板和并适用于多种设计的检测平台，包括微流控平台。固体支持可以以预涂覆的形式提供，其表面含有特定类型的抗体或抗原，涂覆后应在干燥条件下低温（2 – 8℃）储存长达六个月。

吸附剂Adsorbents

在免疫测定过程中，酶联免疫吸附测定（ELISA）的类型不同，所用到的吸附剂类型也会有所不同。ELISA主要使用抗体和抗原作为吸附剂，但多数情况下，采用经亲和层析技术纯化的结合IgG，因这类抗体具有免疫特异性，即便处于低浓度环境下，也能够参与酶促反应。而在某些特殊情形中，则需使用抗物种抗体来替代普通抗体。抗物种抗体是将一种蛋白质注入另一物种体内而产生的，比如把豚鼠血清注入兔子体内，就会产生兔抗豚鼠抗体。

靶向生物分子Target Biomolecules

凭借各异的酶联免疫吸附测定（ELISA）方案，能够检测到来自不同类别的丰富多样的生物分子实体，如人类抗体、脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）、激素、肿瘤标志物、转基因生物、传染因子，以及空气与食物过敏原等（表1）。

表1 ELISA 检测技术所针对的目标生物分子、生物分子的特性以及抗原决定簇

洗涤剂Washing Agents

洗涤过程堪称每个酶联免疫吸附测定（ELISA）方案里的关键步骤之一。具体而言，借助向孔内精准注入特定量（通常为200 μL/96孔板）的洗涤缓冲液并予以清空操作，能够有效去除孔中未发生反应的试剂，显著提升测定的精准度。值得着重留意的是，在免疫测定中，仅能采用特定种类且浓度受到严格把控的洗涤剂，因为若洗涤剂的用量超出适宜范围，极有可能致使生物分子发生变性，进而丧失其原本的活性。一般而言，典型的洗涤缓冲液是由低浓度的非离子型洗涤剂，如含有Tween -20磷酸盐缓冲盐水（PBS）。

封闭阻断剂Blocking Agents

为了提高实验的选择性并减少非特异性结合，实验过程中在将第一种生物分子固定于孔表面之后，通常会进行一个封闭步骤（通常商家提供的是预封闭的固定后的96微孔板）。这一步骤通常是通过添加封闭缓冲液（200 μL/96孔板）来完成的，并且需要持续2 h。常用的蛋白质封闭剂包括牛血清白蛋白（BSA）、新生小牛血清（NBCS）、酪蛋白、脱脂奶粉、正常全血清和鱼明胶等。与洗涤剂不同，蛋白质封闭剂能够永久性地附着在孔表面，从而有效阻止非特异性的分子结合。这一策略有助于确保实验结果的准确性和可靠性。

酶和底物Enzymes and Substrates

酶是大分子生物催化剂，能够加速与被称为底物的其他类型分子的化学反应。在反应时，酶将底物化学修饰为可测量的产物，因此可以进行信号读出。用于酶联免疫吸附测定（ELISA）的酶应满足基本要求，包括高纯度、高转化率、理想的特异性、高稳定性以及结合后保留的活性和催化能力。对于每一类酶，都需要特定类型的底物。底物必须易于制备和储存。此外，底物应与相对较低浓度的酶发生反应，以提高测定的效率。

酶Enzymes

在不同的酶中，辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）是用于标记抗体的两种最常用的酶。这些酶相对便宜且在市场上容易获得，同时具有高的底物转换率。酶与抗体的结合是通过在抗体-抗原相互作用中起作用的类似力实现的。

辣根过氧化物酶（HRP）是辣根过氧化物酶（MW ~44 kD）是最适合的酶制剂之一，以 4:1 的比例与抗体连接（酶：抗体）。HRP是由无色糖蛋白（称为脱辅酶，最大吸收峰在275 nm）和深棕色铁卟啉环化合物（称为辅基，即血红素，最大吸收峰在403 nm）组成的卟啉蛋白。其尺寸小，很少与邻近蛋白质产生位阻；价格便宜，且有多种相应的底物，能产生可溶性或不溶性反应产物。但HRP与包括叠氮化钠在内的各种防腐剂不兼容，水中的金属以及生物样本中的内源性过氧化物酶也会干扰其活性。可以使用超纯水制备的无菌缓冲液和预处理过氧化物酶水平高的样本以减少这种不良影响。

碱性磷酸酶（AP）是从大肠杆菌中提取，大小约为 HRP 的两倍（MW ~ 80 kD）。由于其尺寸较大，能与目标抗体结合的酶数量较少，且可能在抗原-抗体复合物附近产生位阻，降低酶的效率。AP价格比HRP更贵，比HRP更稳定且产生的背景信号更低。AP在接触螯合剂、无机磷酸盐和/或酸性环境（pH<4.5）时会失活，只能在碱性环境中使用。

β-D-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶类别，其分子量约达465 kD，能够通过裂解糖苷键来发挥催化效能。在细胞相关的ELISA方案里，它占据着关键地位。这主要归因于不同细胞类型中的内源性酶活性处于较低水平，并且β-D-半乳糖苷酶与结合至淋巴及非淋巴细胞的抗体之间的结合亲和力较弱。在制备用于此类测定的β-D-半乳糖苷酶连接抗体时，可选用磺-SMCC这类异双功能交联剂开展生产工作。

表2 ELISA中广泛应用的酶的详细信息

酶底物Substrates

在分析检测领域，底物因与酶发生特定反应，为感兴趣的分析物定量提供了多样的途径。底物能够生成有色、荧光或发光的可测量产物，且这些产物的量与结合抗体的酶量呈正相关。产物分为可溶与不可溶两种类型，如TMB、DAB、4CN和BCIP/NBT 等属于常见的产生不可溶产物的底物，TMB、ABTS和OPD等则是产生可溶产物的常见底物。

酶反应结果可通过不同检测方法进行。比色测量是通过记录酶促反应所产生颜色的光密度值来实现检测；荧光检测则借助特定波长的光对反应产物进行激发，进而测量发射出的光子；发光/化学发光检测系统的独特之处在于无需光源激发，依据特定的发光波长开展光学测量（表3）。

表3 ELISA检测相关酶和底物的类型和检测策略

例子：HRP底物

在ELISA实验中，辣根过氧化物酶（HRP）常用的底物包括TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）、ABTS（2,2'-联氨基二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)）和OPD（邻苯二胺）等。TMB是最常用的底物，因其在HRP催化下产生蓝色产物，随后可通过酸终止反应转变为黄色，便于在450 nm波长下测量吸光度。ABTS在HRP作用下生成绿色产物，适合于可见光范围内的测量，但灵敏度较低。OPD则在HRP催化下形成橙色产物，通常在492 nm波长下检测，具有较高的灵敏度，但由于其潜在的致癌性，使用时需注意安全（表4）。

表4 ELISA检测HRP酶底物信息表

图1 ELISA双夹心测定执行步骤概述

终止程序Stopping Process
终止流程的实施，需向反应体系内引入特定化合物，以便能有效防止因酶促反应致使已生成的颜色发生后续改变。尽管终止缓冲液的运用务必遵循各试剂盒所给出的推荐流程，不过仍有部分通用性的注意要点，如终止溶液的保存温度-在将终止缓冲液应用于检测操作之前，其温度必须调整至室温状态。所以，在实际使用该溶液进行检测前，关键在于要仔细确认溶液已彻底溶解，且外观清澈透明，不存在任何结晶现象。

数据读取Reading Techniques

酶联免疫吸附测定（ELISA）中最终产品的信号测量可以通过几种不同的策略来完成，包括比色法（Colorimetric Assay）、荧光法（Fluorescent Assay）和 / 或发光法（Luminescent Assay）读数。

• 比色法

比色法分析可生成能吸收可见光的有色反应产物，其光密度与目标分析物的量呈正比关系，而特定波长通常由产品制造商予以提供。读数信号的判定依据是与所记录的背景信号（信噪比）进行对比。比色检测在视觉的判断、纸质生物诊断设备（如怀孕测试纸条）的发展、手持生物诊断领域的进步、偏远或农村地区以及那些资源匮乏难以获取集中实验室设施的环境中的应用、以及智能设备和数据大规模传输降低检测的不确定性等方面均有重要用途。在科研领域HRP/TMB体系，可在450nm检测光吸收进行定量检测，这也是比较常见的。

• 荧光法

在荧光测定法中，偶联酶可将底物转化为一种名为荧光团的终产物，这类荧光团通常为多环芳烃或杂环化合物。当受到特定波长的光激发时，荧光团会吸收能量并跃迁至激发态，而在其回归原始能量状态的过程中，便会释放出荧光。所记录的荧光单位数值，一般与目标分析物的浓度呈现出比例关系。相较于比色测定法，荧光测定法具有更高的灵敏度。不过，也正因其高度的灵敏性，该方法往往容易产生较高的背景信号。

• 发光法

在发光免疫测定的进程中，酶能够促使底物发生转化，生成一种独特的广反应产物。此反应产物在从电子激发态回落到原始态时产生的向外发射的光子。不同类型的发光测定法，诸如生物发光、化学发光以及光致发光，它们实现电子激发的途径各有差异。在生物发光领域，借助生物发光化合物，例如荧光素与萤火虫荧光素酶的协同作用，便可产生光亮。而化学发光则是通过化学反应来达成，主要是凭借氧化反应以及催化中间产物的形成，以此激发光的产生。光致发光的运行机制与荧光策略较为相似。

生物发光和化学发光在各类免疫测定中均有着广泛的应用。鉴于发光化合物具备高度的敏感性，这类测定不仅能够生成显著增强的信号，而且还拥有宽泛的动态范围。发光检测技术堪称最为灵敏的检测手段，其优势在于能够产生强烈且持久的发光效果、背景信号较低，并且信号能够实现倍增与放大。在测量方面，发光以相对光单位（RLU）为计量标准，且该数值通常与目标分析物的浓度呈比例关系。

生物分子与Plate表面的初始相互作用Initial Interaction of the Biomolecules with the Surface

在ELISA平台的制造过程中，固相（Plate）需要具备适宜的物理与化学特性以有助于蛋白质的固定，固定于表面的蛋白质，需要维持其完整性、天然构象以及生物功能与活性。聚苯乙烯（PS），作为孔板（如96孔板）制造的主要材料，其本身性质呈惰性，目前已采用了大量不同的处理技术来对PS（或其他类似制造材料）的表面加以修饰，进而产生诸如羟基（−OH）、胺基（−NH₂）或羧基（−COOH）等理想的表面官能团。借助这些官能团物理或化学途径，可将生物分子进行更好的固定，如抗原或抗体等与固相表面的结合。同样合理数量和分布的官能团也扮演着重要角色，若表面的官能团数量不足。倘若表面处理方法无法生成足够的反应性官能团，那么在固体表面附近，蛋白质就可能丧失其活性，若过度官能化，其表面会因蛋白质失活而引发空间排斥现象，当表面官能团的恰当分布时，能够实现高效且成功的蛋白质固定（图2）。

图2 不同浓度的表面官能团在每种情形下蛋白质固定的效果

蛋白质附着的固定化技术Immobilization Techniques for Protein Attachment

多种固定化技术被用于酶、抗体、抗原和不同类型蛋白质在支撑表面的固定，在食品工业、从废水中去除有机化合物、环境污染物的原位测量、代谢物控制和生物传感器应用等方面得到了广泛应用（表4）。

• 物理固定Physical Immobilization

物理固定主要通过离子相互作用（静电相互作用）、疏水相互作用和氢键将目标生物分子与固体基质进行固定，此方法在临床ELISA有广泛应用。支撑基质的表面官能团如-COOH（羧基）能够与蛋白质的官能团（如-NH₂）相互作用，并通过离子吸引导致蛋白质附着固定。有研究发现，离子相互作用相较于其他两种作用力在蛋白质固定方面的影响微乎其微，氢键对蛋白质固定的影响力已被证实强于疏水相互作用。尽管如今已开发出更为复杂多样的固定技术，然而在临床实践领域，依旧主要依赖于将目标生物分子直接附着于材料表面的方式。生物受体表面的相对疏水性与理想表面官能团的共存状况相结合，能够显著提升蛋白质固定的有效性。

• 诱捕固定Immobilization via Entrapment

抗体与抗原在膜或凝胶材料内的捕获，构成了另一种较为简易的固定化方法诱捕固定（Immobilization via Entrapment）。在该方法中，材料的渗透性具有极为关键的意义，因其能够直接左右最终检测信号的灵敏度，并对背景噪声产生影响。然而，此技术存在一个显著的弊端，即受支撑材料结构所限，在洗涤步骤中，那些未发生反应而被截留的一抗可能无法从材料基质中彻底清除。如此一来，当与二抗偶联时，便容易引发错误信号的产生。故而，这种方法极有可能致使底物产生的背景信号处于过高水平，难以被接受，尤其是在采用诸如夹心或双夹心酶联免疫吸附测定这类更为复杂的实验方案时，此问题更为突出。

• 共价固定Covalent Immobilization

共价固定抗体/抗原是极为常用的方法之一，即便在常规实验室操作流程中亦不例外。该方法通常会将原本既有的稳定官能团转化为半稳定且具高反应活性的官能团，此类官能团能够与蛋白质达成共价键结合。共价固定可借助不同种类的交联剂予以施行。

 通过零长度交叉接头固定Immobilization via Zero-Length Cross Linker

零长度交联剂如戊二醛（GA）、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）和 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）等常用于蛋白质共价固定到基底上。不同的交联剂其功能转化方式差异很大，因此难以实现可重复性。例如最常用的水溶性EDC，可以激活-COOH官能团，以便与生物分子的伯胺直接结合；随后-COOH表面基团可以转化为不稳定的活性O-酰基异脲酯基团，与NHS结合，可以转化为半稳定的NHS-酯基团，它对蛋白质中肽序列（Lys）的-NH₂基团具有高度反应性，从而导致蛋白质在表面上的共价固定。然而，EDC/NHS化学中生成的官能团的多功能性使得该技术的可重复性变得困难，有报告指出这种方法在某些情况下会导致形成酸酐官能团（而不是 NHS-酯基团），而这些酸酐官能团对蛋白质没有反应性。当使用 EDC/NHS 处理旨在激活表面时，蛋白质分子内部的早期交联也可能发生。这些不良影响可能会导致蛋白质活性的丧失，进而导致检测信号差和灵敏度的显著降低（图3）。

 通过间隔物进行共价固定Covalent immobilization via spacers

间隔分子（Spacers）是具有可用于与蛋白质偶联的官能团的分子。它们在蛋白质和底物的固相之间提供距离，从而使蛋白质在表面结合时有更高的空间自由度。在各种间隔分子中，含胺分子如聚乙烯亚胺（PEI）、六亚甲基二胺（HMDA）和 1,2-二氨基丙烷（DAP）是最常用的中间化合物。线性胺间隔分子如 HMDA 尺寸较小，因此与支链间隔分子如 PEI 相比，提供的活性官能团较少。所以，较大的间隔分子通常由于提供的可用活性官能团数量较多而导致更高的固定化速率，这些活性官能团可用于蛋白质的附着。第一步，碳二亚胺化学提供适合将 NHS 酯基团共价连接到间隔分子末端 -NH₂ 官能团的反应性中间官能团。在进一步的步骤中，胺化表面与戊二醛反应，产生醛基，这些醛基可以与蛋白质的伯胺基团形成亚胺键。戊二醛（GA）是一种众所周知的胺反应性同双功能交联剂，经常用于生物化学应用。这种实验策略产生了用于更牢固的蛋白质结合且具有高重现性的反应性官能团。

• 定向固定Oriented immobilization

截至目前，所有提及的固定化策略均可被纳入随机固定化技术的范畴，这是由于在底物上固定蛋白质时，无法对其方向加以控制。随机固定化过程中缺乏直接控制，可能致使抗体/抗原在固定后丧失生物活性，其主要原因在于对称大分子在底物上呈随机分布状态。而通过对表面官能团进行化学修饰，能够达成蛋白质在支撑表面的定向附着，进而提升结合亲和力。在此技术中，凭借这种精准明确的固定化手段，蛋白质得以极为规整有序地附着于表面。这种有序的固定化模式在诸如生物反应器、生物传感器以及生物电子学等诸多领域均具有应用价值。相较于随机固定化方法，该方法的显著优势在于其固定化具有高度的可重复性，因为生物分子是从其特定位点进行固定的。

表5 生物分子表面固定化技术及其在生物传感器中的应用

图3 碳二亚胺反应和-COOH官能团的活化

参考

[1]Shah K, Maghsoudlou P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. Br J Hosp Med (Lond). 2016 Jul;77(7):C98-101. doi: 10.12968/hmed.2016.77.7.C98. PMID: 27388394.

[2] Aydin S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides.2015 Oct; 72:4-15. doi: 10.1016/j.peptides.2015.04.012IF: 2.8 Q2. Epub 2015 Apr 20. PMID: 25908411.

[3]Tabatabaei MS, Ahmed M. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods Mol Biol. 2022; 2508:115-134. doi: 10.1007/978-1-0716-2376-3_10. PMID: 35737237.

[4]Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) From A to Z, https://doi.org/10.1007/978-981-10-6766-2

ELISA相关产品