耶鲁大学研究者最近发现了一群特殊的T细胞—KIR+CD8+T细胞，它们表面上是免疫骑士，实际上却像是隐藏在特洛伊木马中的敌军。这些细胞在黑色素瘤患者体内循环，表面上是来对抗癌症的，但实际上，它们却在抑制抗肿瘤免疫反应，帮助肿瘤逃避免疫监控。这个有趣的研究结果发表在《NatureImmunology》，题目为Circulating Tumor Reactive KIR+CD8+T cells Suppress Anti-Tumor Immunity in Patients with Melanoma，这可能为黑色素瘤免疫治疗提供新的思路。

该研究使用了单细胞RNA测序与单细胞T细胞受体（TCR）测序等实验方法鉴定出一种肿瘤抗原特异性CD8+T细胞亚群，它们在肿瘤和血液中共享，并且类似于最近被描述在调节自身炎症反应中发挥作用的KIR+CD8+调节性T细胞（Tregs）。此外，黑色素瘤患者中循环KIR+CD8+Tregs出现的频率与更差的整体生存率相关。这些结果为CD8+Tregs在调节人类免疫反应中的作用提供了新的证据，可能是另一种肿瘤免疫逃逸的研究方向。

研究方案

1.探索肿瘤和血液中肿瘤反应T细胞的转录图谱和克隆增殖性

实验样本及方法：17对晚期黑色素瘤患者的肿瘤和血液单细胞转录组和单细胞TCR测序，47名晚期黑色素瘤患者的外周血流式细胞术蛋白检测

主要结果（一）：

对循环T细胞进行无监督聚类分析，揭示了16个不同的转录簇，包括8个由CD8+T细胞组成的簇，5个CD4+T细胞簇，两个由CD4+和CD8+T细胞的混合簇，以及一个黏膜相关不变T细胞（MAIT）的簇（图1B）。对肿瘤抗原反应/不反应T细胞的不同细胞亚群比例展示，反应T细胞中基本全是CD8+T细胞（图1C），且血液中预测反应性CD8+T细胞的扩增程度比预测无反应性T细胞更大（图1F）。随着克隆扩增程度的提高，循环中的预测反应性T细胞也表现出更加专一的TCR库。

图1 晚期黑色素瘤患者中的循环肿瘤抗原反应性T细胞

主要结果（二）：

使用局部双样本检测，以肿瘤为参照样本，将血液细胞预测分为反应性或非反应性CD8+T细胞，并对比其细胞的基因差异。结果显示出反应性CD8+T细胞高表达几个自然杀伤细胞相关基因（NKG7、KLRD1、KLRC2、KLRC3、FCG3A），包括编码抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）家族的基因（例如KIR2DL3）。为确认标志基因在KIR+/KIR-CD8+细胞亚群蛋白水平上的表达，使用多参流式细胞术进行Helios，Tbet，Perforin，IFNγ蛋白检测，发现KIR+/-预测反应性CD8+T细胞的标志基因蛋白水平差异显著。

图2 KIR+CD8+调节性T细胞在循环肿瘤抗原反应性CD8+T细胞中的丰度不同

主要结果（三）：

为了理解血液中预测的反应性KIR+CD8+T细胞的分化状态与其他CD8+T细胞的关系，进行了拟时序分析。将具有原始分化状态的克隆相关细胞定义为分化轨迹的起点，观察到三个分支谱系（图3A）。反应性KIR+CD8+T细胞的亚群在谱系2（IKZF2差异关联）中富集，而转录上类似于无反应性CD8+T细胞的细胞在谱系1中富集（ZNF683差异关联）。为了解反应性KIR+CD8+T细胞的转录状态是否也存在于肿瘤微环境中，对反应性T细胞和克隆相关细胞的亚群进行了分析（图3D），其中同时在血液和肿瘤中预测为反应性KIR+CD8+T细胞的差异表达的基因被认为是在不同组织间保守表达的标志性基因（图3F），且肿瘤中保守标志性基因的表达与血液中的表达呈正相关（R = 0.394, p = 0.005；图3G）。

图3 循环和肿瘤中KIR+CD8+肿瘤抗原反应性T细胞之间的关系

2.功能层面确认预测的反应性KIR+CD8+T细胞对肿瘤抗原的特异性

实验样本及方法：12例黑色素瘤单细胞转录组和单细胞TCR测序做TCR序列筛选，6例黑色素瘤和癌旁全外显子测序、转录组做新抗原分析；TCR序列转染实验，主要组织相容性复合体（MCR）构建及特异性肿瘤反应实验。

主要结果：

通过高通量表位筛选鉴定KIR+CD8+T细胞克隆型的肿瘤抗原特异性，当与来自KIR+CD8+T细胞或对照组的16.A2细胞共培养时，响应的MCR报告细胞（NFAT+）的流式结果具有较强信号，并得到MCR反应性的KIR+CD8+T细胞克隆型（TCR2328、TCR2409、TCR2647）、其他KIR+CD8+T细胞或KIR–CD8+T细胞分组的保守KIR+CD8+基因签名表达。组间差异通过Wilcoxon配对符号秩检验进行测量（p < 0.05, ****p < 0.001）。值得注意的是，在所有针对肿瘤抗原的克隆型中，三个KIR+CD8+克隆型中的两个（TCR2328和TCR2409）是单细胞测序数据中唯一在肿瘤和血液中都被鉴定出来的TCR。

图4 高通量表位筛选显示KIR+CD8+T细胞克隆型中的肿瘤抗原特异性

3.肿瘤抗原反应性的KIR+CD8+T细胞的临床相关性

实验样本及方法：3例黑色素瘤患者血液CITEseq，基于临床变量和选择的表面蛋白基因表达构建Lasso Logistic模型，单细胞测序数据集或47例患者（29例肿瘤样本，18例血液样本）流式细胞术检测蛋白量进行生存分析。

主要结果：

未经历免疫治疗患者单细胞RNA测序队列生成的训练和测试数据集具有较高的预测性能（训练集：AUC为0.864，测试集：AUC为0.867；图5A）。应用于免疫治疗后疾病进展的患者（免疫治疗抵抗队列）也显示出可接受的预测性能（AUC为0.753），这表明该模型可能具有普遍性，不受过去治疗历史的影响。将这个模型应用于合并的单细胞测序数据集中，使用中位数作为标准来定义患者中预测反应性KIR+CD8+T细胞的高（大于中位数）或低（小于或等于中位数）频率，我们观察到血液中预测反应性KIR+CD8+T细胞比例较高的患者三年内的整体生存期更短（p=0.037；图5B）。这种相反的关联在免疫治疗抵抗队列中尤为明显（p=0.029；图5C）。

图5 肿瘤抗原反应性、KIR+CD8+T细胞的临床相关性

结语

本研究表明KIR+CD8+ Tregs在晚期黑色素瘤患者中具有潜在的临床相关性。重要的是，血液中KIR+CD8+ Tregs的存在是肿瘤免疫微环境的一个标志，为进一步探索这一群体作为循环生物标志物和潜在治疗靶点提供了合理性。且无论治疗史如何，KIR+CD8+ Tregs的预后意义进一步增加了这一群体不受当前免疫检查点抑制剂治疗影响的可能性，可能涉及治疗抵抗的相关机制。深入了解KIR+CD8+ Tregs在肿瘤微环境中的功能，可能会促进免疫治疗未来的发展。

引用文献

Hafler, David, et al. "Circulating Tumor Reactive KIR+ CD8+ T cells Suppress Anti-Tumor Immunity in Patients with Melanoma." Research Square (2024).