心肌梗死（Myocardial Infarction，MI）是全球重大健康问题，现有治疗手段存在局限。为了解决这一问题，近日苏州大学苏州医学院第一附属医院心血管外科&心血管科学研究所的研究团队在《Chemical Engineering Journal》（IF=15.1）上发表题为“Room-temperature-stable immunosuppressive nanovesicles for mitigating immunopathology and streamlining cardioprotection post-infarction”的突破性研究文章，开发一种新的治疗策略，以解决MI治疗中T细胞驱动的免疫病理学问题。APExBIO团队为本文的实验研究提供了高品质的组织和细胞裂解液产品：RIPA Lysis Buffer (Strong, without inhibitors) (Cat. No：K1120)
Fig1 冻干PD-L1@NV减轻T细胞激活，缓解免疫病理学并提供心脏保护的机制图
研究背景
心肌梗死（MI）是全球范围内导致发病和死亡的主要原因之一。免疫系统对心肌损伤的响应激活对组织愈合和维持至关重要，然而，过度的组织坏死可能引发持续炎症，破坏免疫耐受，进而导致有害的心室重构。在MI过程中，自身反应性T淋巴细胞，尤其是CD8毒性T淋巴细胞，在缺血心肌中被动员和激活，释放炎症介质，对心肌造成损害。T淋巴细胞通过免疫检查点（如PD-1/PD-L1）相互作用来维持自身耐受和避免自身免疫，这为开发基于调节T细胞活性的治疗策略提供了理论依据。基于细胞膜的纳米囊泡递送系统具有生产可扩展性和结构优势，但传统的基于分泌组的细胞外囊泡疗法稳定性差且成本效益低，而冷冻干燥技术为开发稳定的纳米囊泡制剂提供了可能。
研究工作
1. T淋巴细胞在心肌梗死进展中的变化：
为探究T淋巴细胞在心肌梗死（MI）进展中的功能及变化特征。研究通过重新分析来自梗死小鼠心脏的公开单细胞测序数据（GSE163465），对免疫细胞进行聚类分析、细胞类型注释、差异基因表达分析及基因集富集分析。研究发现MI后T淋巴细胞比例增加，可分为六个子集，其中CD8T淋巴细胞从MI后第3天开始显著扩增并持续至第14天，其相关基因表达上调，参与细胞周期、增殖、炎症因子产生和淋巴细胞迁移等过程，表明MI后CD8T淋巴细胞增殖和激活增强，可能导致长期过度炎症反应。
Fig2 T淋巴细胞高度异质性，在整个MI进程中被强烈激活
2. 冻干PD-L1@NV的制备与表征：
为构建基于慢病毒的PD-L1@MSC细胞系，制备并表征新鲜及冻干的PD-L1@NV（frPV和lyoPV），评估其特性及稳定性，研究通过慢病毒转导构建PD-L1@MSC细胞系，经超声破碎、密度梯度超速离心和连续挤压制备纳米囊泡，再用冷冻干燥法制lyoPV，然后利用免疫荧光、流式细胞术、透射电子显微镜、动态光散射和Western blot等技术对不同制剂进行表征。研究发现成功构建PD-L1@MSC细胞系，其能准确表达膜性PD-L1-FLAG蛋白，制备的lyoPV在室温下保持稳定，形态、粒径、电位和蛋白表达与frPV相似，表明冻干过程未影响其特性，且具有免疫调节功效。
Fig3 冻干PD-L1@NV的生成和表征
3. PD-L1@NV对CD8T淋巴细胞的靶向结合及复杂调节作用：
为研究PD-L1@NV与CD8T淋巴细胞的物理结合及对其功能的调节作用。研究通过检测PMA/ionomycin激活的 Jurkat 细胞中PD-1mRNA水平，观察新鲜和冻干PD- L1@NV与激活Jurkat细胞的共定位情况，对PD-L1@NV处理的CD8T淋巴细胞进行RNA-seq分析，包括差异基因表达分析、KEGG和GO分析以及基因集富集分析。研究发现激活的Jurkat细胞中PD-1mRNA水平升高，PD-L1@NV与激活的Jurkat细胞和CD8T淋巴细胞的细胞膜显著共定位，RNA-seq分析显示其调节多种基因表达，富集于与免疫、复制和修复、细胞生长和死亡相关的通路，抑制CD8T淋巴细胞的增殖和激活，表明PD-L1@NV可通过复杂机制调节CD8T淋巴细胞功能。
Fig4 通过PD-L1@NV有针对性地结合和复杂的细胞功能
4. PD-L1@NV对CD8T淋巴细胞增殖和激活的抑制作用：
为进一步验证PD-L1@NV对CD8T淋巴细胞增殖和激活的抑制作用。研究采用CFSE稀释法检测PD-L1@NV对小鼠CD8T淋巴细胞增殖的影响，用EdU掺入法检测其对人外周血单核细胞（PBMC）增殖的影响，通过ELISPOT测定评估其对小鼠CD8T淋巴细胞细胞因子产生的影响。研究发现CFSE和EdU实验表明PD-L1@NV显著抑制CD8T淋巴细胞增殖，ELISPOT测定显示其减少IFN-γ分泌，证明PD-L1@NV可抑制CD8T淋巴细胞的增殖和激活，从而可能减轻缺血性炎症。
Fig5 PD-L1@NV对CD8T淋巴细胞增殖和活化的抑制作用
5. PD-L1@NV在体内的生物分布：
为探究PD-L1@NV在体内的分布情况，评估其在MI治疗中的潜在应用价值。研究通过免疫组化检测健康和MI小鼠心肌中PD-1蛋白表达水平，用DiR标记PD-L1@NV后尾静脉注射MI小鼠，利用体内成像系统观察其在心脏和其他主要器官中的积累情况。研究发现MI小鼠心肌中PD-1蛋白表达高于健康小鼠，且缺血区高于远程区，DiR标记的PD-L1@NV在MI小鼠心脏中积累增加，在肝脏中积累减少，表明PD-L1@NV在MI小鼠心脏中有一定的靶向性。
Fig6 体内免疫抑制PD-L1@NV的生物分布
6. 工程化PD-L1@NV在体内的心脏保护作用：
为评估工程化PD-L1@NV对MI小鼠心脏功能的保护作用及其机制。研究通过建立MI小鼠模型，尾静脉注射NV或PD-L1@NV，部分小鼠同时注射PD-L1中和抗体（aPD-L1），通过超声心动图评估心脏功能，测量心脏重量，进行Masson三色染色评估梗死面积。研究发现PD-L1@NV治疗显著改善MI小鼠心脏功能，减少梗死面积，降低心脏重量，增加存活心肌组织，而aPD-L1可逆转这些治疗效果，证实PD-L1@NV的心脏保护作用依赖于PD-1/PD-L1轴。
Fig7 体内工程PD-L1@NV的心脏保护作用
7. PD-L1@NV对T细胞动态的免疫调节作用：
为研究PD-L1@NV治疗后MI小鼠体内T细胞动态变化，探讨其免疫调节机制。研究通过建立MI小鼠模型，尾静脉注射PD-L1@NV，部分小鼠同时注射aPD-L1，通过流式细胞术分析心脏和脾脏中CD8+CD3+毒性T淋巴细胞、CD4+CD3+辅助T淋巴细胞和CD25+CD4+CD3+调节性T淋巴细胞的频率，检测脾脏中IFN-γ和颗粒酶B产生细胞数量及缺血心脏中相应mRNA水平。研究发现PD-L1@NV治疗显著降低心脏和脾脏中 CD8+CD3+毒性T淋巴细胞频率，增加调节性T淋巴细胞比例，降低脾脏中IFN-γ和颗粒酶B产生细胞数量及缺血心脏中相应mRNA水平，且aPD-L1可逆转这些作用，表明PD-L1@NV可有效调节T细胞群体和功能，促进MI恢复。
Fig8 钝后MIT细胞分析通过免疫抑制PD-L1@NV
8. CD8T淋巴细胞清除对PD-L1@NV心脏保护作用的影响：
为阐明PD-L1@NV心脏保护作用与CD8T淋巴细胞的关系，进一步验证其作用机制。研究通过建立MI小鼠模型，部分小鼠先注射CD8中和抗体（aCD8）清除CD8T淋巴细胞，然后尾静脉注射PD-L1@NV，通过超声心动图评估心脏功能，测量心脏重量，进行Masson三色染色评估梗死面积。研究发现清除CD8T淋巴细胞后，PD-L1@NV的心脏保护作用显著减弱，梗死面积增加，心脏重量相对增加，表明PD-L1@NV的心脏保护作用主要通过抑制CD8毒性T淋巴细胞实现。
Fig9 CD8T淋巴细胞的消除大大减弱了PD-L1@NV的心脏保护作用
9. PD-L1@NV的体内安全性评估：
为全面评估PD-L1@NV在体内应用的安全性。研究通过建立MI小鼠模型，尾静脉注射PD-L1@NV，在第28天收集血清检测肝肾功能指标（AST、ALT、BUN、CRE），对脑、脾、肾、肺和肝等器官进行H&E染色观察组织形态，进行溶血试验检测免疫原性。研究发现PD-L1@NV治疗后小鼠关键器官组织结构、细胞形态和免疫细胞浸润无明显改变，肝肾功能指标稳定，溶血风险低，表明lyoPV在体内应用具有良好的生物安全性。
Fig10 PD-L1@NV的安全性评估
10. PD-L1@NV的器官分布和药代动力学：
为研究PD-L1@NV在体内的器官分布和药代动力学特征。研究通过用DiR标记PD-L1@NV尾静脉注射MI小鼠，在不同时间点通过体内成像系统观察其在器官中的分布，测量荧光强度绘制药代动力学曲线。研究发现肝脏是PD-L1@NV的主要积累部位，其信号强度随时间下降，而其他器官荧光强度相对稳定，为理解PD-L1@NV在体内的行为提供了依据。
Fig11 PD-L1@NV的器官分布和药代动力学
研究结论
研究开发了一种基于PD-L1的免疫抑制纳米囊泡（PD-L1@NV），通过抑制CD8T淋巴细胞的增殖和激活，减轻缺血性免疫病理，支持心肌组织修复。PD-L1@NV通过破坏PD-1/PD-L1相互作用，抑制T细胞活化，并在体内调节T细胞动态，展现出显著的心肌保护作用。
文章精彩看点
创新的治疗策略：开发了一种基于慢病毒、富含PD-L1的室温稳定纳米囊泡（PD-L1@NV）用于MI治疗，为解决T细胞驱动的免疫病理学问题提供了新途径。
深入的机制研究：从细胞和分子水平深入探究了PD-L1@NV对CD8T淋巴细胞的作用机制，以及其在体内调节T细胞动态、改善心脏功能的机制，涉及基因表达、信号通路等多方面分析。
多技术综合应用：运用单细胞测序、RNA测序、多种细胞实验技术（如CFSE染色、EdU测定、ELISPOT测定等）以及体内成像、组织学染色等技术，全面系统地研究了纳米囊泡的特性、功能和疗效。
稳定性优势突出：通过冷冻干燥技术制备的lyoPV在室温下稳定，克服了传统纳米囊泡制剂稳定性差的问题，提高了其应用潜力。
不足之处（文中）
研究模型的局限性：虽然在小鼠模型中取得了一定成果，但小鼠与人类在生理和病理方面存在差异，研究结果在人类临床应用中的有效性和安全性仍需进一步验证。
长期疗效和潜在风险研究不足：研究主要关注了短期治疗效果，对于PD-L1@NV的长期疗效和潜在长期风险（如长期免疫抑制可能导致的感染风险增加等）未进行深入探讨。
缺乏对其他细胞类型的全面研究：研究重点聚焦于T淋巴细胞，对MI过程中其他免疫细胞或心肌细胞与纳米囊泡的相互作用研究相对较少，可能忽略了整体免疫微环境中的其他重要因素。
后续可展开角度
临床转化研究：开展临床前大动物模型研究，进一步评估PD-L1@NV在接近人类生理条件下的疗效和安全性，为临床试验提供更充分的数据支持，推动其向临床应用转化。
长期随访研究：设计长期随访实验，监测接受PD-L1@NV治疗的MI患者或动物模型的长期心脏功能、免疫状态以及潜在并发症，全面评估其长期疗效和安全性。
联合治疗研究：探索PD-L1@NV与其他MI治疗方法（如药物治疗、干细胞治疗等）的联合应用效果，可能通过协同作用提高治疗效果，为MI治疗提供更优化的综合策略。
细胞相互作用网络研究：深入研究纳米囊泡与MI微环境中多种细胞类型（如巨噬细胞、成纤维细胞等）的相互作用，构建更完整的细胞相互作用网络，以更好地理解其在MI修复中的作用机制。
个性化治疗研究：根据患者的个体差异（如基因多态性、免疫状态等），探索PD-L1@NV治疗的个性化策略，实现更精准的MI治疗。
参考文献
[1] Tang et al. (2024) Room-temperature-stable immunosuppressive nanovesicles for mitigating immunopathology and streamlining cardioprotection post-infarction. https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.157030
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