背景

新冠mRNA疫苗的成功加速mRNA作为新型药物的发展，引发人们对其他医疗应用的新热情，特别是在癌症治疗方面。与传统方法相比，成熟的体外合成(IVT) mRNA技术可以在更短的时间内大量生产mRNA，费用相应降低。同时IVT mRNA化学修饰和脂质纳米颗粒等递送平台的发展能让mRNA在宿主细胞稳定翻译成蛋白质，这些蛋白质可以作为肿瘤抗原刺激免疫反应，或作为补充的额外有益蛋白以抑制肿瘤生长。目前许多基于mRNA的癌症疗法正开展临床前或临床研究，显示出极大的应用前景。

IVT mRNA的组成及设计

与天然mRNA相似，IVT mRNA同样包含5’Cap、5’非翻译区（5’ UTR）、编码序列（CDS）、3’非翻译区（3’ UTR）和poly (A) 尾。IVT mRNA可以进行序列优化，使其比内源性mRNA更好地利用蛋白翻译机制，并提升其稳定性来实现蛋白表达水平和持续时间。比如3’ UTR通过增加某类富含AU片段（ARE）可以提高IVT mRNA的稳定性；使用更常用的密码子替换稀有密码子进行CDS区域的密码子优化，可以提高mRNA的翻译；另外，研究表明，密码子第三位富含GC (GC3)比富含AU (AU3)的mRNA具有更高的核糖体阅读率和蛋白表达效率。同时，核苷酸的化学修饰可以调节IVT mRNA的免疫原性，增加mRNA的稳定性和表达效率，如常见的N1-甲基假尿苷的应用等等。

图1 IVT mRNA的结构和设计考虑因素

基于mRNA的癌症疗法

在癌症治疗方面，2017年首次报道了将针对多种抗原的个性化mRNA癌症疫苗应用于黑色素瘤患者的临床试验。此除之外，已有多个基于mRNA的疗法处于临床前/临床开展阶段，包括各类mRNA编码的肿瘤抗原、免疫调节因子、肿瘤抑制因子、抗体以及基因编辑等治疗方案。

图2  基于mRNA的癌症治疗概述

肿瘤抗原mRNA

mRNA肿瘤疫苗根据癌细胞表达的肿瘤抗原进行特异性设计，能在体内触发强烈的抗肿瘤免疫反应。肿瘤抗原主要包括肿瘤相关自身抗原（TAAs）和肿瘤特异性抗原（TSAs）两类。TAAs通常在肿瘤细胞中过表达，最常用做肿瘤疫苗，但TAAs也存在于正常组织中，而且哺乳动物对单一的TAAs具有高度的免疫耐受性，使得其肿瘤特异性和免疫原性较弱，因此目前流行设计多种TAA组合的方式，以提高癌症疫苗的疗效。例如，治疗黑色素瘤的BNT111，编码四种TNAAs（NY-ESO-1、MAGE-A3、酪氨酸酶和TPTE），单独或与PD-1抑制剂联合的临床试验显示出积极效果。

TSAs作为来自肿瘤细胞突变的新抗原，在正常组织中不表达，具有较高的肿瘤特异性和免疫原性。因此，TSA疫苗（新抗原疫苗）是治疗癌症的一种有吸引力的疫苗形式。目前编码多种新抗原的个性化疫苗已经开发出来，包括黑色素瘤防复发疫苗mRNA-4157/ V940，是编码多达34种新抗原的单一mRNA，联合帕博利珠单抗治疗展现长期生存获益。TSA疫苗代表了癌症治疗领域的前沿技术，但由于TSA疫苗设计复杂，以及生产成本较高，仍面临广泛应用的限制。

图3 编码肿瘤相关抗原或新抗原的mRNA癌症疫苗的开发

细胞因子mRNA

使用重组细胞因子进行癌症临床治疗已有数十载，如IL-2和IFNα2b都已被FDA批准用于某些癌症的治疗。然而细胞因子的半衰期较短，通常需要每天多次给药，可能引起不良免疫反应，因此全身性细胞因子给药面临安全性，治疗效果不理想等问题。与重组细胞因子相比，IVT mRNA序列可优化，可快速和经济有效地生产大量编码细胞因子的mRNA，将其封装在纳米颗粒中可以在系统注射和局部环境中延长细胞因子的半衰期。例如，对IFNα mRNA进行GC序列优化，并更换UTR而获得的IFNα 变体mRNA。相比天然IFNα mRNA，可引起更高的IFNα蛋白表达。IL-12目前也是重点研究用于mRNA治疗的细胞因子，一项肝癌小鼠模型中，静脉注射IL-12 mRNA-脂质纳米颗粒体内检测无毒性，并可有效激活免疫应答。目前，IL12 mRNA （MEDI1191）的安全性和有效性目前正在进行临床评估（NCT03946800）。此外，与编码单个细胞因子的mRNA-脂质纳米颗粒相比，用编码两种或更多种合作细胞因子mRNA混合物治疗可以诱导对肿瘤更广泛的免疫效应。例如，肿瘤内传递包裹编码IL-23、IL-36和OX40L的mRNA的混合物，可以产生强大的抗肿瘤反应，目前正处于临床评估中（NCT03739931）。另外一项分别编码四种人类细胞因子（GM-CSF、IFNα、IL-15-sushi和scIL- 12）的mRNA混合物能在黑色素瘤的异种移植小鼠内引起显著的IFNγ产生，并已开展临床研究（NCT03871348）。

图4 编码细胞因子的mRNA癌症治疗

肿瘤抑制因子mRNA

抑癌基因可以抑制细胞增殖从而抑制肿瘤发展，在许多肿瘤中已发现抑癌基因的缺失或失活。通过小分子抑制剂、蛋白质递送或质粒DNA等转染肿瘤细胞来恢复抑制功能已在体内外得到广泛探索，但这些策略普遍存在较大局限性。已有研究使用纳米颗粒递送mRNA以诱导抑癌因子的快速表达，显示出治疗的巨大潜力。

p53是主要的抑癌基因，在约50%的癌症中发生突变。一项P53缺失的肝细胞癌和非小细胞肺癌肿瘤小鼠模型中，静脉注射编码P53蛋白的mRNA纳米颗粒能使p53蛋白恢复到高水平，达到显著的肿瘤治疗结果。PTEN是另外一类重要的抑癌基因，PTEN缺失可促进肿瘤对化疗的耐药性，并减少肿瘤内T细胞浸润。使用PTEN mRNA纳米颗粒与抗PD1抗体联合使用可以在皮下PTEN突变的黑色素瘤和原位PTEN阴性前列腺肿瘤模型中诱导显著的抗肿瘤作用。赖氨酸特异性去甲基化酶6A（KDM6A）在膀胱癌中被公认为是一种肿瘤抑制因子，它的缺失增加罹患膀胱癌的风险，一项研究表明膀胱内递送KDM6A mRNA纳米颗粒能够阻止KDM6A缺失的人膀胱瘤小鼠的转移，显示其治疗潜力。其他表现特征良好的肿瘤抑制因子也被评估为用于mRNA治疗。

图5 编码抑癌因子的mRNA癌症治疗

基因编辑mRNA

CRISPR-Cas9由于速度、精度和有效性等优势，是目前被广泛使用的基因编辑工具。使用CRISPR-Cas9特异性破坏癌细胞生存基因是癌症治疗的新思路。与传统癌症治疗相比，CRISPR-Cas9基因编辑是永久性的，可避免多次重复给药。Cas9可以作为蛋白质、DNA或mRNA等形式递送。直接递送Cas9蛋白会引起机体不良免疫反应，还会被快速降解，导致基因编辑维持时间较短。而且，Cas9蛋白相当大，对于使用病毒和非病毒载体的有效装载具有挑战性。另外以质粒或病毒等DNA的形式递送Cas9会在体内产生蛋白的持续表达，可能引发较高的脱靶效应和毒性。IVT mRNA作为瞬时表达方式，不仅极大减少潜在的脱靶效应，还能最大限度地减少细胞核中的遗传毒性。

使用脂质纳米颗粒递送编码Cas9的mRNA已被用于癌症治疗，但经典纳米颗粒的肝靶向性一直制约CRISPR-Cas9的进一步应用。通过调整脂质纳米颗粒配方，如补充脂质纳米颗粒配方与选择性器官靶向（SORT）分子或使用新型可电离的磷脂（iPho），允许将Cas9 mRNA和sgRNA靶向到小鼠的其他部位如脾脏和肺，完成正常小鼠组织特异性基因编辑，显示出特异性癌症靶向治疗的希望。另一项研究表明，Cas9 mRNA和sgRNA共封装在抗体工程脂质纳米颗粒中，能够针对胶质母细胞和卵巢肿瘤进行70%以上的基因编辑效率。

图6 Cas9 mRNA介导的基因组编辑用于癌症治疗

结语

尽管mRNA在癌症治疗中展现出巨大潜力，但仍有许多挑战需要克服。首先，筛选、优化合适的肿瘤抗原是设计和开发mRNA癌症疫苗的关键步骤，需要进一步发展高通量测序技术。此外，靶向递送的平台也需扩展，以覆盖全身器官组织的mRNA靶向递送。对于mRNA的给药途径也不应仅局限在注射方面，应扩展口服、雾化吸入等给药途径的可能性。另外环状RNA和自复制RNA等新型RNA技术开发可以实现更持久的体内抗肿瘤蛋白表达，产生更有效的治疗结果，也能弥补mRNA本身不稳定，避免反复给药的缺陷。总之，mRNA技术为癌症治疗带来了新的希望。尽管面临诸多挑战，但其灵活性和可编程性使其成为一种极具潜力的治疗工具。随着科学研究的不断深入和技术的不断进步，mRNA有望在未来的癌症治疗中发挥更大的作用，为患者带来更有效和个性化的治疗方案。

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主要参考文献

1. mRNA-based cancer therapeutics. Nat Rev Cancer. 2023; 23(8): 526-543.
2. mRNA-Based Therapeutics in Cancer Treatment. Pharmaceutics. 2023; 15(2): 622