背景

酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种广泛应用于生物医学研究和诊断的技术，其发展历史可以追溯到20世纪中期，其起源与免疫学和酶学的进步密切相关。在20世纪50年代，免疫学家开始探索利用抗体的特异性来检测和定量生物分子。1960年代，放射免疫测定（RIA）技术的出现标志着免疫检测技术的一个重要里程碑，然而，RIA使用放射性同位素，存在安全性和废物处理的问题。1971年，瑞典科学家Peter Perlmann和Eva Engvall首次描述了ELISA技术，这一创新性的方法使用酶作为标记物，取代了放射性同位素。酶标记的抗体可以与特定的抗原结合，通过酶催化的显色反应实现检测，这种方法不仅提高了安全性，还简化了操作流程。随着技术的不断进步，ELISA逐渐演变出多种形式，包括直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA和竞争ELISA等，每种形式都有其特定的应用场景和优缺点。ELISA技术的灵活性和高灵敏度使其在疾病诊断、疫苗开发、食品安全检测和环境监测等领域得到了广泛应用。进入21世纪，ELISA技术继续发展，结合自动化和高通量筛选技术，进一步提高了检测效率和精确度。尽管近年来新兴技术如质谱和生物传感器等不断涌现，ELISA仍然是实验室和临床诊断中的重要工具。

图1 ELISA发展史整理

原理

酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种用于检测和定量分析蛋白质、抗体、激素等生物分子的实验技术。其基本原理是利用抗原与抗体的特异性结合，通过酶标记的抗体与底物反应产生可测量的信号（通常是颜色变化），从而间接反映样品中目标分子的含量。ELISA通常包括四个步骤：包被、封闭、检测和显色，广泛应用于医学诊断、食品安全和生物研究等领域。

图2 四种ELISA原理示意图

分类

根据操作原理和应用目的分为直接法 (Direct ELISA)、间接法 (Indirect ELISA)、夹心法(Sandwich ELISA)、竞争法 (Competitive ELISA)、和多重法（Multiplex ELISA）等几种。夹心法ELISA依靠其高灵敏、特异性强以及抗原无需事先纯化等特点，逐渐成为检测各种蛋白质等大分子抗原的检最常用的方法之一。近年来，双抗夹心法中的一步法及多因子检测新技术也逐渐成熟。

ELISPOT（酶联免疫斑点检测）是一种类似“夹心法“的检测方法，用于检测接种到由PVDF膜提供支持的微孔板微孔中的细胞所分泌的蛋白质，类似蛋白质印迹法，但其结果是膜表面的斑点。

表1 不同ELISA试剂盒区别汇总

应用

细胞因子检测，如白介素IL、TNF、VEGF等;

肿瘤标志物检测，如结直肠癌的糖类抗原19-9（CA19-9）和癌胚抗原（CEA）等;

病毒检测，如流感病毒、脑炎病毒、狂犬病毒等检测;

自身免疫病抗体检测，如类风湿关节炎的抗核抗体（ANA）检测等；

激素含量检测，如胰岛素、雌二醇、皮质醇等;

载脂蛋白检测，如ApoA-l、Apo-E等;

血液药物浓度检测，如治疗心脏病的药物地高辛、抗生素庆大霉素等。

夹心法试剂盒常见组成

以K4705 Human IL-7 ELISA Kit为例

此类试剂盒为即用型预包被ELISA试剂盒，非常适合Human IL-7的定量检测。

夹心法ELISA通用型实验操作步骤

1  准备预包被的96孔plate

2  添加样品至到孔中 进行抗体捕获

3  洗去未捕获的物质

4  添加检测抗体（偶联HRP）与抗原上的第二个位点结合

5  洗去未结合的检测抗体

6  添加HRP反应底物TMB，氧化为蓝色

7  添加终止反应液，变为黄色

8 酶标仪检测450nm处光吸收值

图2 夹心法ELISA试剂盒使用流程图

常见问题与解答

表2 ELISA中的常见错误及其可能的原因和解决方法

参考

[1]Shah K, Maghsoudlou P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. Br JHosp Med (Lond). 2016 Jul;77(7):C98-101. doi: 10.12968/hmed.2016.77.7.C98. PMID: 27388394.

[2] Aydin S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides.2015 Oct; 72:4-15. doi: 10.1016/j.peptides.2015.04.012IF: 2.8 Q2. Epub 2015 Apr 20. PMID: 25908411.

[3]Tabatabaei MS, Ahmed M. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods Mol Biol. 2022; 2508:115-134. doi: 10.1007/978-1-0716-2376-3_10. PMID: 35737237.

[4]Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) From A to Z, https://doi.org/10.1007/978-981-10-6766-2

产品