背景

信使RNA (mRNA) 在20世纪60年代首次被发现以来，由于其能利用内源性翻译系统瞬时表达特定的蛋白质，将其作为治疗药物特别有吸引力，与病毒载体或DNA相比，mRNA可以很容易地在体外设计合成，具有较低的宿主基因组整合风险更快的发挥效应。但mRNA药物研究也一直存在挑战，包括mRNA本身的不稳定、免疫原性和递送困难等。目前通过掺入碱基修饰核苷酸可以减低mRNA的免疫原性，并增强mRNA在体内的稳定性和翻译效率。另外，脂质纳米颗粒（LNP）已被验证可有效进行mRNA递送，并最终被FDA批准用于SARS-CoV-2新冠疫苗。

两款FDA批准上市的mRNA新冠疫苗由N1-甲基假尿苷修饰及LNP包被配方[1]

上述提及的mRNA改进工作虽极大加速mRNA的药物转化，但线性mRNA在系统给药后仍会受到普遍存在的RNases快速降解，较短的半衰期阻碍了mRNA其他应用扩展，如通常需要长时间蛋白质表达的蛋白质替代疗法，通过重复给药可以解决短暂的持续时间，但可能会导致潜在毒性，并且频繁的给药也对mRNA治疗药物提出更高的生产需求。为了解决这些问题，近年来可翻译的环状RNA（circRNA）和自复制RNA（Self-Amplifying RNA）成为研究的热点。它们不仅在基础生物学中具有重要意义，还在医药领域展现出巨大的潜力。

环状RNA

环状RNA是一类特殊的单链RNA分子，其结构呈闭合环状，缺乏5'端帽子和3'端尾巴。这种环状结构使其在细胞内具有更高的稳定性，不易被核酸外切酶降解。虽然大多数天然的环状RNA为不能翻译蛋白质的非编码RNA，但经证明通过人工合成带有IRES（内部核糖体进入位点）序列的环状RNA可在体内进行翻译。

高度稳定的环状RNA相比线性mRNA能更加有效表达蛋白[2]

1 RNA环化方式

环状RNA的前体是线性RNA，可以在体外通过酶或化学连接等方式将其环化，合成编码目标蛋白的环状RNA。目前体外进行RNA环化主要包括三种方式：化学连接、酶法连接和核酶剪接作用。

2 化学连接

化学连接指通过化学试剂和反应条件将线性RNA分子末端连接形成环状结构，通常依赖于特定的化学试剂，如碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），这些试剂能够活化RNA分子末端的羧基和氨基，从而促进末端之间的共价键形成。化学连接方法不依赖于生物酶，可以在体外精确控制反应条件和产物，但化学连接的效率可能较低，需要优化反应条件以减少副产物的生成，且化学试剂的使用可能引入非天然的化学修饰。

使用溴化氰（BrCN）或1-乙基氰基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）可以实现线性RNA前体的5’和3’磷酸二酯键连接[3]

3 酶法连接

酶法连接依赖于连接酶的催化作用，这些酶能够识别RNA分子末端的特定结构，并催化磷酸二酯键的形成，从而实现RNA分子的环化。常用的酶包括T4 RNA连接酶和T4 DNA连接酶。酶法连接具有较高的特异性和效率，能够在温和的反应条件下实现RNA的环化。但由于受到底物结构和序列的限制，某些RNA分子可能难以被有效环化。此外，酶的活性和稳定性可能受到反应条件的影响。

单磷酸化的RNA可以通过T4 DNA连接酶、T4 RNA连接酶1或T4 RNA连接酶II来实现酶促环化[3]

4 核酶剪接作用（PIE系统）

核酶是一类具有催化活性的RNA分子，能够在不依赖蛋白酶的情况下催化RNA的剪接和连接，主要包括PIE（Permuted Intron-Exon system）I型内含子或II型内含子自剪接。在PIE系统中，I型和II型内含子被设计为环化反应的催化核心，通过两步转酯化反应实现自身的剪接和外显子环化连接。核酶剪接作用具有高度的序列特异性和自催化能力，能够在无外源酶的条件下实现RNA的环化，但也受RNA分子结构和序列的限制而使得某些RNA分子难以被有效环化。目前短链RNA环化一般通过化学连接法或酶法合成，而长链RNA则主要使用PIE（permuted intron-exon）自催化剪接系统进行环化。

PIE法在体外生成环状RNA示意图。I型内含子自剪接：只需要添加GTP和Mg2+作为辅助因子，通过正常的I型内含子自剪接反应实现RNA连接，最终的环状RNA将包含外源性外显子序列(A)；II型内含子：涉及到外显子末端的5’剪接位点与同一外显子开始处的3’剪接位点的连接。最终的环状RNA序列准确，不会像I型内含子一样残留外源外显子序列[4]

环状RNA相比线性mRNA的明显优点在于稳定性方面得到扩展，在治疗应用方面，环状RNA对于疫苗或蛋白质替代策略都有巨大潜力，并且环状RNA对于Toll 样受体(TLR)感应较低，相比线性mRNA具有更低的免疫原性，但环状RNA的环化过程、纯化和分析表征尚未在大规模实施中得到完全验证，后续环状RNA的实践需要制定更为标准化的管理规范。

自复制RNA

自复制RNA(saRNA)是指能够在没有DNA模板的情况下，通过RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）进行自我复制的RNA分子，这类RNA在病毒学中尤为常见。自复制RNA包含编码RdRP的非结构蛋白(nsPs)区域，亚基因组启动子(SGP)，以及SGP下游的可以被替换成编码目的蛋白或抗原的结构蛋白序列。

传统非复制mRNA和自复制mRNA比较。两者都具有相同的基本元件，包括一个帽、5’ UTR、3‘ UTR和poly (A)尾。自扩增RNA（saRNA）还编码4个非结构蛋白（nsP1-4）和一个来自甲病毒基因组的亚基因组启动子。nsP1-4编码复制酶，负责saRNA扩增的作用，使非复制mRNA的剂量更低[5]。

saRNA相比常规线性mRNA具有许多优势，saRNA可以通过自我介导的RNA转录本的合成使得所需蛋白质的翻译呈指数扩增，因此可以解决线性非自复制mRNA的瞬时和有限翻译能力的弱点，不仅可以用于开发疫苗，还用于其他治疗策略。比如，对于蛋白质替代疗法有明显的优点，因为一次性低剂量的saRNA给药即可导致长期持续的蛋白质表达，无需重复给药。

BALB/c小鼠肌肉注射4 ug saRNA（每条腿2mg）或PBS中编码荧光素酶基因的合成mRNA。sa-RNA的荧光素酶表达延迟，在转移后第8天达到峰值，峰值水平是mRNA的5倍，比mRNA的峰值水平持续约10天[6]

尽管自复制RNA不使用病毒载体，但saRNA在翻译过程中会出现双链RNA结构，可能激发高强度的先天免疫反应，而且翻译的复制酶本身也来自病毒蛋白，导致炎症或其他副作用，在不同的给药途径和给药载体上，需要进一步研究以优化RNA序列降低其免疫原性风险，以促进saRNA的各种应用。

1 自复制RNA修饰

saRNA高效的蛋白表达能力使其成为疫苗的理想选择，然而迄今为止的saRNA疫苗临床实验结果却差强人意，数据表明由于saRNA免疫原性导致的早期强烈IFN反应抑制其抗原表达并诱导炎症。最通用的降低RNA免疫原性的方法当然还是修饰核苷酸的使用，比如，N1-甲基假尿苷是目前常规线性mRNA疫苗药物使用最为广泛的修饰核苷酸，但据许多研究报道，使用N1-甲基假尿苷合成的saRNA反而会抑制蛋白表达活性，这可能是由于引入修饰核苷酸改变了saRNA的序列结构，导致RdRp无法正常识别关键元件，因此主流观点认为saRNA中不适合使用修饰核苷酸。

非修饰saRNA和N1-甲基假尿苷(N1mΨ)修饰的saRNA存在表达局限性，正确使用与saRNA兼容的修饰核苷酸可以发挥saRNA的巨大优势[7]

在此背景下，Grinstaff 等人使用26种修饰核苷酸合成mcherry-saRNA，以荧光蛋白信号作为转染效率的评估指标，筛选出saRNA三种效率最高的修饰核苷酸，分别是5-羟甲基胞苷（hm5C）、5-甲基胞苷（m5C）和5-甲基尿苷（m5U）。

使用5-羟甲基胞苷（hm5C）、5-甲基胞苷（m5C）或5-甲基尿苷（m5U）修饰的saRNA转染效率相比未修饰的saRNA (wild type)均有显著提升[7]

并且比较N1mΨ修饰的Luc-saRNA和5mC修饰的Luc-saRNA在小鼠体内的表达情况，发现5mC修饰的Luc-saRNA在注射后长时间内保持高水平蛋白表达。相反，N1mΨ修饰的Luc-saRNA在注射后24小时蛋白表达量迅速抵达峰值，随后，表达量随着时间增加而持续走低。检测从注射后24小时小鼠早期IFN反应，与非修饰saRNA相比，接受N1mΨ mRNA或m5C saRNA治疗的小鼠的血清IFNα1水平显著降低。

小鼠静脉注射含2.5 µg 非修饰、N1mΨ修饰或m5C修饰的Luc-saRNA/LNP后不同时间点的生物发光图像及血清中测定IFNα1蛋白水平[7]

他们的工作对saRNA中使用修饰核苷酸会抑制表达活性这一观点提出质疑，证明引入与saRNA兼容的修饰核苷酸一样可以抑制免疫原性，并继续提升蛋白表达水平。

LNP递送

RNA需要借助递送载体才能在体内被有效摄取，脂质纳米颗粒（LNP）是目前最成功的RNA药物递送系统。经典LNP由促进与细胞膜融合的辅助磷脂，稳定LNP结构的胆固醇，防止聚集的聚乙二醇化脂质以及促进内体逃逸的可电离的脂质组成，能够有效地封装和保护活性成分，克服与RNA递送相关的挑战，包括：(1)RNA容易被血清中的核糖核酸酶降解；(2)RNA难以绕过细胞膜进入细胞内空间。

常规线性mRNA、saRNA和CircRNA的结构和封装示意图[8]

目前LNP已被证明成功应用于包括环状RNA、saRNA在内的核酸递送，如新冠circRNA[2]、癌症circRNA疫苗[9]等开发。而早在2012年Andrew J. Geall等人即首次采用LNP递送编码呼吸道合胞病毒RSVF蛋白的saRNA疫苗，使用的LNP配方稍有调整，即DLinDMA（可电离阳离子脂质）：DSPC：胆固醇：PEG-DMG2000的摩尔比为40:10:48:2，氮磷比为8:1，结果显示RSVF saRNA疫苗可在小鼠体内高效特异性的血清抗体和细胞免疫反应。

自扩增RNA结构及包裹自扩增RNA的脂质纳米颗粒（LNP）脂质组分示意图[10]

尽管LNPs具有成本较低，可以规模化生产等许多优点，但它们并非没有局限性。首先，热稳定性仍然是一个挑战，因为作为疫苗载体需要极低的运输和储存温度，同时LNP成分的炎症性质可能导致不良的副作用。另外，LNPs的传统配方容易在肝细胞中积聚，也限制了其在肝外靶点的使用。目前的研究集中在开发冻干的LNP配方，探索更好的低温剂或脂质替代品，并通过开发脂质及配方优化等方式研究新的靶向递送系统，以有效地解决其局限性。

结论

环状RNA和自复制RNA代表了RNA医药技术的两个重要延伸方向，环状RNA以其稳定性和持久的抗原表达为特点，而自复制RNA则以高效的抗原表达和低剂量需求为优势。未来，通过优化RNA设计、LNP递送系统改进和扩大应用范围，这两种RNA有望在传染病防控、癌症治疗和个性化医疗中发挥更大的作用，为人类健康带来更多的可能性。

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参考文献

[1]COVID-19 mRNA vaccines: Platforms and current developments. Mol Ther. 2022; 30(5): 1850-1868.

[2]Circular RNA vaccines against SARS-CoV-2 and emerging variants. Cell. 2022; 185(10): 1728-1744

[3]The design and synthesis of circular RNAs. Methods. 2021; 196:85-103.

[4]Circular RNA: Biosynthesis in vitro. Front Bioeng Biotechnol. 2021; 9:787881.

[5]An Update on Self-Amplifying mRNA Vaccine Development. Vaccines (Basel). 2021; 9(2): 97.

[6]Self-Amplifying RNA Vaccines Give Equivalent Protection against Influenza to mRNA Vaccines but at Much Lower Doses. Mol Ther. 2018; 26(2): 446-455.

[7]Complete substitution with modified nucleotides in self-amplifying RNA suppresses the interferon response and increases potency. Nat Biotechnol. 2024; doi: 10.1038/s41587-024-02306-z.

[8]Vaccines' New Era-RNA Vaccine.Viruses. 2023; 15(8): 1760.

[9]Circular RNA cancer vaccines drive immunity in hard-to-treat malignancies. Theranostics. 2022; 12(14): 6422-6436.

[10]Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines. PNAS. 2012; 109(36): 14604-9.