随着纳米医学的发展，实现药物的精准递送至器官、组织、细胞乃至细胞内生物大分子已成为核心目标之一。同时，随着递送目标细化到细胞和亚细胞层面，探索纳米药物在分子层面的递送机制变得尤为重要。然而，由于缺乏有效的技术手段，纳米药物在细胞内的递送机制至今尚未完全阐明，这限制了纳米药物的临床转化。为了解决这一问题，近日北京大学药学院药学系研究团队在《Nano-Micro Letters》（IF=31.6）上发表了题为“Molecular Mechanisms of Intracellular Delivery of Nanoparticles Monitored by an Enzyme-Induced Proximity Labeling ”的突破性研究文章，本研究开发了一种酶诱导的邻近标记技术（nano-EPL），用于实时监测与细胞内纳米药物相互作用的蛋白质。APExBIO团队为本文的实验研究提供了高品质的生物素基酪氨酰胺（Biotin-tyramide）产品：Biotin-tyramide (Cat. No：A8011)。

文章图形摘要

Fig 1 HRP (+)- PNPs的构建示意图及酶诱导接近标记技术（nano-EPL）在巨噬细胞内传递纳米颗粒的动态分子图谱示意图。

研究背景

纳米药物在改善药物分子的吸收、分布、代谢和排泄方面发挥重要，且不同材料的纳米药物能够提供不同的递送和分布特性。尽管许多纳米材料已被用于构建递送系统以促进纳米药物的发展，但许多纳米药物的生物学行为和它们如何影响药物递送的机制仍然不清楚，这限制了它们的临床应用。特别是纳米药物在细胞内的递送机制，包括从内体到溶酶体的囊泡运输过程，仍然不明确。由于缺乏技术手段来实时检测纳米药物在细胞内递送过程中的相互作用蛋白，作者提出了开发一种新的酶诱导近距离标记技术（nano-EPL）的必要性，以实时监测巨噬细胞内与纳米药物相互作用的蛋白质，从而揭示纳米药物在细胞内的递送机制，这对于理解巨噬细胞如何影响纳米药物的递送和疗效至关重要。

Fig 2 PNPs和HRP (±)-PNPs的制备与表征

HRP(+)-PNPs在细胞内的标记能力：

为了验证HRP(+)-PNPs在细胞内标记相互作用蛋白的能力，文中将HRP(+)-PNPs与巨噬细胞共孵育，并在不同时间点添加BP和H2O2触发标记反应，使用共聚焦显微镜和Western blot分析标记蛋白。结果表明HRP(+)-PNPs在细胞内能有效标记与纳米颗粒相互作用的蛋白质，且标记能力受到BP和H2O2的共同影响。

Fig 3 HRP (+)-PNPs细胞内递送过程中相互作用蛋白的原位标记活性

HRP(+)-PNPs在巨噬细胞内的囊泡递送特性：

为了探究HRP(+)-PNPs在巨噬细胞内的囊泡递送路径，文中使用Cy5标记的纳米颗粒追踪其在细胞内的递送过程，并通过共聚焦显微镜观察其分布。结果表明HRP(+)-PNPs在巨噬细胞内通过囊泡途径递送，迅速被运送至吞噬体，并与其他细胞器如内质网、高尔基体和溶酶体发生相互作用。

Fig 4 吞噬体中心过程在细胞内传递HRP(+)-PNPs

HRP(+)-PNPs在巨噬细胞内的动态分子剖面：

为了构建HRP(+)-PNPs在巨噬细胞内的动态分子剖面，识别不同时间点相互作用的蛋白质，文中利用nano-EPL技术标记蛋白质，并通过质谱技术进行蛋白质鉴定和定量分析。结果表明通过动态分子剖面分析，揭示了与HRP(+)-PNPs相互作用的蛋白质随时间的变化，发现了不同细胞器在纳米颗粒递送中的参与时间线。

Fig 5 巨噬细胞中HRP (+)-PNPs细胞内传递的动态分子谱

不同细胞器在HRP(+)-PNPs递送中的参与时间线：

为了明确不同细胞器在HRP(+)-PNPs递送过程中的具体参与时间，文中基于质谱数据，对不同细胞器的蛋白质进行聚类分析，并通过共聚焦显微镜验证特定蛋白质的共定位。不同细胞器如内质网、早期内体、晚期内体、高尔基体和溶酶体在HRP(+)-PNPs的递送中有不同的参与时间线，揭示了细胞内递送的复杂性。

Fig 6 参与细胞器的蛋白质组学分析

HRP(+)-PNPs递送过程中细胞器的详细参与时间线：

为了详细描绘HRP(+)-PNPs递送过程中细胞器的动态变化和参与时间线，文中通过质谱分析和共聚焦显微镜观察，分析特定细胞器标记蛋白与生物素标记蛋白的共定位变化。研究确定了细胞器在HRP(+)-PNPs递送中的详细参与时间线，为理解纳米药物的细胞内递送机制提供了新的视角。

Fig 7 详细的细胞器参与时间表在细胞内传递HRP(+)-PNPs

不同细胞器对基因药物递送效率的影响：

为了评估不同细胞器在HRP(+)-PNPs递送过程中对基因药物递送效率的影响，文中使用光敏剂Ce6加载纳米颗粒，通过激光照射触发光动力破坏吞噬体膜，释放基因药物，并观察基因药物在细胞内的递送效率。J结果表明不同细胞器的参与对基因药物的递送效率有显著影响，提供了设计具有溶酶体和内体逃逸能力的纳米材料的时间窗口。

Fig 8 基因载药纳米颗粒的细胞内递送效率

研究结论

本研究通过开发一种新型的酶诱导近距离标记技术（nano-EPL），实现了对纳米药物在巨噬细胞内递送过程中与蛋白质相互作用的实时监测。研究发现HRP(+)-PNPs在巨噬细胞内的递送是一个以吞噬体为中心的过程，涉及内质网、高尔基体、内体和溶酶体等多个细胞器的动态参与。不同细胞器在纳米药物递送过程中有特定的参与时间线，这些细胞器的参与对纳米药物的递送效率有显著影响。通过动态分子剖面分析，揭示了纳米药物递送过程中蛋白质相互作用的动态变化，为理解纳米药物的细胞内行为提供了新的视角。

文章精彩看点

• 技术创新：首次将酶诱导近距离标记技术应用于纳米药物的细胞内递送研究，为实时监测纳米药物与蛋白质的相互作用提供了新的技术手段。
• 动态分子剖面：通过质谱技术构建了纳米药物递送过程中的动态分子剖面，揭示了细胞器参与的详细时间线，这是对纳米药物递送机制的重要补充。
• 细胞器参与时间线：明确了不同细胞器在纳米药物递送中的独立参与时间线，为设计更有效的纳米药物递送系统提供了重要的时间和空间信息。

不足支持（文中）

• 细胞模型的局限性：研究主要在J774A.1细胞系中进行，可能无法完全代表其他类型细胞的行为，限制了研究结果的普适性。
• 技术复杂性：nano-EPL技术的实施需要较高的技术水平，可能限制其在其他实验室的推广应用。
• 动态监测的局限性：虽然研究揭示了时间线，但对某些瞬态相互作用的捕捉可能仍存在局限。

后续可展开角度

1. 新技术的开发：开发更为简便、高效的技术手段，以便于在更广泛的研究中应用，进一步推动纳米药物的研究和应用。
2. 不同细胞类型的研究：在其他类型的细胞（如肿瘤细胞、干细胞等）中验证nano-EPL技术的适用性，以评估其普适性。
3. 药物递送效率的优化：基于研究结果，设计具有更高内源性逃逸能力的纳米药物，以提高药物递送效率。
4. 临床转化研究：将研究成果应用于临床前研究，评估纳米药物在体内的递送效果，为临床应用提供依据。
5. 机制深入研究：深入研究不同细胞器参与纳米药物递送的具体机制，特别是它们如何影响药物的释放和细胞内稳定性。

参考文献

[1] Ren J, Zhang Z, Geng S, Cheng Y, Han H, Fan Z, Dai W, Zhang H, Wang X, Zhang Q, He B. Molecular Mechanisms of Intracellular Delivery of Nanoparticles Monitored by an Enzyme-Induced Proximity Labeling. Nanomicro Lett. 2024 Feb 1;16(1):103. doi: 10.1007/s40820-023-01313-0. PMID: 38300384; PMCID: PMC10834923.