研究背景

肿瘤相关巨噬细胞（TAM）重编程是很有前途的癌症免疫治疗方法，然而用于TAM重编程的重组细胞因子如IFN-γ等因为生物活性较低而疗效不尽如人意。目前基于mRNA的治疗方法具有很大潜力，但mRNA本身由于不稳定容易降解，使其可持续表达蛋白的能力较差。为了解决上述问题，上海交通大学课题组受混合动力车辆中动能回收系统（KERS）概念的启发，设计出一种类似的细胞因子疗效回收系统（CERS），通过纳米矿物涂层的“捕获和稳定”机制，能够显著降低TAM重编程所需的IFN-γ mRNA的剂量，提高IFN-γ的生物活性，增强抗肿瘤免疫反应。团队工作发表在Adv. Mater杂志上，题为KERS-Inspired Nanostructured Mineral Coatings Boost IFN-γmRNA Therapeutic Index for Antitumor Immunotherapy。论文中用于表达IFN-γ的mRNA（货号R1999）交由APExBIO定制合成。

研究结果

CERS原理

动能回收系统（KERS）是一种功率控制系统，通过在制动过程中储存能量，随后释放回收的动能进行加速，从而提高燃料效率(示意图 1B)。团队受KERS启发而设计出细胞因子疗效回收系统（CERS）作为mRNA递送载体。CERS内添加的矿物涂层微粒（MCMs）既可以有效改善基因表达，又可以原位捕获并稳定住表达的蛋白，从而延长治疗时间(示意图 1C)。

示意图1. 受KERS混合动力汽车的概念而启发设计的CERS示意图

mRNA介导的CERS的制备与表征

首先作者选择经典递送系统脂质纳米颗粒(LNP)作为mRNA递送载体，根据示意图1A中所示的关键步骤，构建具有高效转染mRNA和主动捕获细胞因子的CERS/LNP。并为了改善LNP对巨噬细胞的转染能力，使用半乳糖（TAMs表达高水平的半乳糖受体）合成修饰的Gal-LNP。流式细胞术显示，Cy5.5-LNPs修饰不同浓度的半乳糖后，与RAW264.7巨噬细胞的结合显著增加(图1D)。使用携带EGFP mRNA的Gal-LNP分别转染RAW264.7巨噬细胞和K7M2肿瘤细胞，同样表明Gal-LNP提高了EGFP mRNA的巨噬细胞转染能力(图1E)。作者接着以羟基磷灰石颗粒为核心制备MCMs，使Gal-LNP表面均匀覆盖纳米结构的矿物涂层，即CERS(图1G-H)。然后用有丝分裂失活的细胞来论证CERS介导的mRNA递送效率。结果显示使用CERS装载的EGFP mRNA转染经丝裂霉素C处理使有丝分裂失活的RAW264.7巨噬细胞的转染效率比用EGFP pDNA高2.3倍(图1F)，并且EGFP mRNA的转染效率随着MCM的增加而加强（图1I）。最后免疫染色显示mRNA@LNP(红色)和溶酶体(绿色)很少重叠，表明CERS能促进mRNA内吞体的有效逃逸，从而获得更高的转染效率。

图1. mRNA介导的CERS的制备和鉴定

CERS能积极捕获并稳定细胞因子

作者接下来将CERS系统用于递送表达免疫治疗细胞因子IFN-γ 的修饰mRNA (cmRNA)，验证其表达和抗肿瘤治疗效果。ELISA结果显示CERS/IFNγ mRNA转染RAW264.7巨噬细胞和原代细胞骨髓源性巨噬细胞(BMDM)，表达IFN-γ的浓度和IFNγ mNA的剂量成正相关(图2A-B)。为了证明MCM捕获和稳定细胞因子的能力，作者接下来分别使用不含MCM涂层的IFN-γ cmRNA@LNP和含MCM涂层的IFN-γ cmRNA@CERS转染CERSsRAW264.7巨噬细胞(图2D-E)。结果表明使用cmRNA@CERS转染后表达的IFN-γ浓度比cmRNA@LNPs组高38.4%。cmRNA@CERS组不仅在所有时间点都表现出较高的表达，而且CERS也能更好的维持mRNA表达的持续时间(图2F)。作者接着进行的皮下肿瘤模型实验同样证明CERS在体内的有效性，因为经ELISA检测肿瘤部位IFN-γ的表达情况发现IFN-γcmRNA@CERS组的IFN-γ表达水平始终高于IFN-γ cmRNA@LNPs组，而且mRNA@CERS组中IFN-γ的表达时间延长了约2倍(图2H)。综上所述，CERS能有效地改善IFN-γ基因cmRNA在体内外的表达，并显著增加了IFN-γ基因的表达持续时间。

图2. CERS积极捕获并稳定细胞因子

通过CERS递送的IFN-γ cmRNA能将TAMs重新编程为杀肿瘤表型

前文提到IFN-γ已被广泛用于重编程TAM以抑制肿瘤的生长，但其有效性不佳。因此作者试图利用CERS系统递送IFN-γ mRNA将TAM重编程为杀伤肿瘤巨噬细胞，以增强巨噬细胞的杀伤肿瘤能力。作者比较了IFN-γ cmRNA@LNPs和IFN-γ cmRNA@CERS之间的巨噬细胞极化效果，流式细胞检测可以发现IFN-γ cmRNA@CERS组中CD206阳性细胞(TAM的标志物)的比例降至5.11%，而IFN-γ cmRNA@LNPs组仅降至12.2%，因此IFN-γ cmRNA@CERS能更有效地将TAM重编程为肿瘤杀伤巨噬细胞。相应的，CD86阳性巨噬细胞（杀伤肿瘤巨噬细胞的标记物）的比例也从40.2%增加到56.1%，反映出CERS介导的IFN-γ cmRNA翻译更能激活杀瘤巨噬细胞(图3B)。免疫荧光染色也验证CD86和CD206的表达与流式细胞分析结果一致(图3C)。这些结果表明，CERS介导的IFN-γ cmRNA递送是重编程TAM的有效工具，能成功改善其向杀伤肿瘤巨噬细胞的转化。

图3. 通过CERS递送的IFN-γ cmRNA进一步将TAMs重编程为杀瘤表型

CERS介导的IFN-γcmRNA生物活性优于重组IFN-γ蛋白

上述实验结果已经表明使用IFN-γ cmRNA@CERS进行TAM重编程的有效性和可行性，但相比直接使用重组IFN-γ蛋白是否存在优势仍不得而知。为了验证CERS mRNA产生的IFN-γ相比重组IFN-γ(rIFN-γ)蛋白能更有效的重编程效应细胞，作者对rIFN-γ(10 ng mL−1)和IFN-γcmRNA@CERS进行了一系列的头对头的比较，以证明使用CERS生成的IFN-γ具有更优越的生物活性。流式细胞显示IFN-γ cmRNA@CERS组的CD206阳性细胞的比例仅为rIFN-γ 6.5%，而CD86阳性细胞的比例则是rIFN-γ的2.08倍(图4A-B)，表明IFN-γcmRNA@CERS能更有效地引发巨噬细胞的极化。免疫荧光染色同样也证实了和流式细胞一致的结果(图4C)。而且，IFN-γ cmRNA@CERS还能更有效地增加巨噬细胞的杀伤活性，因为IFN-γ cmRNA@CERS处理后的iNOS阳性巨噬细胞 (NO的产生是TAM重编程后杀肿瘤活性的标志）的比例是rIFN-γ处理的2.19倍(图4D-E)。此外，与rIFN-γ相比，IFN-γcmRNA@CERS也促进了更强的NO产生(图4F-G)。

图4 .通过CERS介导的cmRNA产生的IFN-γ的生物活性高于重组IFN-γ蛋白

CERS介导的IFN-γcmRNA通过TAM重编程机制能有效抑制肿瘤生长

接下来作者通过建立K7M2骨肉瘤荷瘤小鼠模型研究CERS/mRNA的潜在治疗效果(图5A)。分别使用rIFN-γ、IFN-γ cmRNA@LNPs以及IFN-γ cmRNA@CERS处理模型鼠，可以看见IFN-γ cmRNA@CERS治疗组呈现最慢的肿瘤生长速度和最小的肿瘤体积(图5C-D)。此外，H&E染色和Ki-67染色均显示与IFN-γ cmRNA@LNPs和rIFN-γ组相比，IFN-γ cmRNA@CERS更能引起肿瘤细胞损伤并显著抑制肿瘤细胞增殖水平(图5E)。通过流式细胞术对肿瘤内细胞进行分类，评估治疗后肿瘤内巨噬细胞表型变化，与之前的TAM体外重编程结果类似，即IFN-γ cmRNA@CERS组中的CD206+F4/80+CD11b+细胞（TAM生物标志物）下降到17.0%，而rIFN-γ组只下降到36.5%，IFN-γcmRNA@LNPs组则下降到25.3%，这意味着IFN-γcmRNA@CERS更有效地重编程TAM促炎表型。相应地，相比rIFN-γ组和IFN-γ cmRNA@LNPs组，cmRNA@CERS治疗也更有效的增加CD86阳性巨噬细胞（杀伤肿瘤巨噬细胞的标记）(图5F)，表明IFN-γ cmRNA@CERS能更有效地诱导杀肿瘤巨噬细胞，发挥更强的免疫调节作用。

图5. CERS介导的IFN-γ cmRNA通过TAM重编程机制有效抑制肿瘤生长

CERS介导的IFN-γ cmRNA与αPD-L1联合使用能引起骨肉瘤小鼠模型中更强的抗肿瘤免疫反应

之前的研究表明IFN-γ与αPD-L1联合治疗具有更强的抗肿瘤能力，作者接下来验证通过与αPD-L1协同治疗能否实现CERS/mRNA在体内更强的抗肿瘤作用（图6B）。与单独IFN-γ cmRNA@CERS组相比，IFN-γ cmRNA@CERS+αPD-L1组表现出更慢肿瘤生长速度和更小的肿瘤体积，暗示CERS/mRNA结合αPD-L1在体内能发挥更强的抗肿瘤能力（图6D-E）。与IFN-γ cmRNA@CERS治疗和αPD-L1单独治疗组相比，IFN-γ cmRNA@CERS结合αPD-L1引起更有效的肿瘤细胞损伤和更低的肿瘤细胞增殖水平(图6F)。此外，与IFN-γ cmRNA@CERS组相比，IFN-γ cmRNA@CERS+αPD-L1中CD206阳性巨噬细胞比例较低，CD86阳性巨噬细胞比例较高(图6G)，表明IFN-γ cmRNA@CERS结合αPD-L1能更有效地诱导杀瘤巨噬细胞，产生更强的免疫调节作用。综上所述，IFN-γ cmRNA@CERS与αPD-L1的联合治疗有力的促进了抗肿瘤免疫微环境。

图6. CERS介导的IFN-γ cmRNA引起骨肉瘤小鼠模型中更强的抗肿瘤免疫反应

CERS介导的IFN-γ cmRNA和αPD-L1联合治疗能抑制小鼠骨肉瘤肺转移

最后，肺转移被认为是影响肿瘤预后的一个主要因素，在本研究中，作者也评估IFN-γ cmRNA@CERS+αPDL1联合治疗对骨肉瘤治疗引起的肺转移的影响(图7A)。作者建立K7M2-Fluc骨肉瘤肺转移模型。通过生物发光成像检测，PBS对照组小鼠的肺部K7M2肿瘤细胞发出强烈的荧光信号。相比之下，IFN-γ cmRNA@CERS+αPD-L1组和IFN-γ cmRNA@CERS组的肺组织呈现出较低的荧光信号，提示IFN-γ cmRNA@CERS治疗抑制小鼠骨肉瘤的肺转移(图7B)。比较肺表面的转移灶数量可以发现，IFN-γ cmRNA@CERS+αPD-L1组在抑制骨肉瘤肺转移过程中显示最佳效果(图7C-D)。肺组织H&E染色显示肿瘤病灶在IFN-γ cmRNA@CERS+αPD-L1组种几乎没有发现(图7E)，表明IFN-γcmRNA@CERS+αPD-L1的协同治疗能极大抑制骨肉瘤肺转移。

图7. CERS介导的IFN-γ cmRNA联合αPD-L1能抑制小鼠骨肉瘤肺转移

结论

本文开发了一种受KERS启发而设计的CERS系统，用于克服重组细胞因子低生物活性的治疗困境。CERS可以驱动更有效的基于mRNA的治疗性细胞因子的表达，捕获和稳定细胞因子，从而极大提高细胞因子疗效，并显著降低细胞因子给药的成本和副作用。CERS产生的IFN-γ可以有效地重组TAMs以抑制骨肉瘤的增殖；此外，CERS介导产生的IFN-γ和αPD-L1的联合免疫治疗能增强肺转移的抑制能力。因此CERS介导的mRNA治疗为有效和持续的细胞因子生物治疗提供了一种新的策略，适用于广泛的医学应用。