随着Moderna和BioNTech两家公司开发的新冠疫苗的问世，人类正式迈入了mRNA技术的新时代。mRNA疫苗因其研发和生产周期短、无需细胞体系、高效表达靶蛋白以及无整合入基因组的风险等显著优势,而日益受到广泛关注。尽管在设计mRNA分子时已经融入了帽子结构（cap）、非翻译区（UTR）和聚腺苷酸尾（polyA）等模块，并且采用了核苷酸修饰技术，但这些设计元素并不能完全防止mRNA在体内被迅速代谢，从而可能显著影响mRNA疫苗或药物的疗效。

自复制RNA（self-amplifying RNA，简称saRNA）和环状RNA（circRNA，简称circRNA）作为新兴的RNA技术平台，展现出了解决mRNA药物疗效短暂和作用力不足的潜力。这两种先进的RNA分子设计，通过延长药物在体内的循环时间和增强其生物活性，为未来的基因治疗和疫苗开发带来了革命性的前景。

环状RNA

环状RNA（circular RNA是一类特殊的非编码RNA分子，它们具有闭合的环状结构，没有5'到3'的极性，与线性RNA相比circRNA比线性RNA更稳定，不易被细胞内的RNA降解酶降解，因此在细胞内可以存在较长时间，尽管circRNA最初被认为是非编码RNA，但近年来的研究发现，它们确实具有编码蛋白的潜力。当前，体外合成环状RNA（circRNA）的主要方法包括化学合成、酶促连接以及I型和II型内含子核酶。在这些方法中，尤其是通过核酶催化的环化技术，因其高效性和广泛的适用性，已经成为最为广泛采用的环状RNA合成策略。

图1. Group I型核酶成环原理

2018年MIT研究学者R. Alexander Wesselhoeft设计出反向自剪切的group I型circRNA，首次证实工程化的circRNA可在真核细胞内稳定、高效表达蛋白^[1]。随后，环码生物成功推出了其独创的Group II型circRNA技术，并基于此技术开发了一系列产品管线。同时，近年来国内多家RNA领域的公司也在积极钻研circRNA的成环核心技术，旨在突破国际RNA巨头的专利壁垒，为国内RNA疗法的发展开辟新的道路。

环状RNA（circRNA）的免疫原性问题一直是学术界和产业界关注的焦点。有研究认为，通过核酶环化后的circRNA携带的外源外显子序列可能是引发免疫反应的主要原因之一。为了解决这一问题，科学家们正在努力开发不包含外源序列的circRNA，以期降低其免疫原性。2022年，科锐迈德开发出了一项名为clean-PIE的技术，该技术成功地从circRNA中移除了外源序列^[2]。研究结果显示，使用clean-PIE技术制备的circRNA其免疫原性得到了显著降低。

图2.clean-PIE技术合成无外源序列的circRNA

在2024年9月21日，中国科学院纳米生物效应与安全性重点实验室的曹宇虹研究员团队在预印本平台bioRxiv上发表了题为“Mitigating Cellular Dysfunction by Addressing Contaminants in Synthetic circRNA”的研究论文^[3]。该研究综合分析了circRNA合成过程中产生的RNA副产物的免疫原性，并开发了一种结合纤维素过滤和酶处理的逐步纯化策略，以减轻合成环状RNA的免疫原性。这种新的纯化方法不仅能够减轻免疫应答，还能增强circRNA的表达，显著提升生产效率。该研究指出，circRNA的免疫原性主要来源于合成过程中产生的双链RNA（dsRNA）和带有三磷酸集团的线性RNA。这些发现为优化circRNA的生产和应用提供了新的思路。

图3.新型纯化方法提高circRNA纯度

值得注意的是，就在本文撰写之际，转录本（上海）生物科技有限公司（RiboX Therapeutics，简称"RiboX"）宣布了一个里程碑式的成就：其自主研发的用于治疗放射性口干症的创新药物RXRG001，已获得美国食品药品监督管理局（FDA）的新药临床试验申请（IND）批准。RiboX即将在美国开展I/IIa期临床试验SPRINX-1，这是全球首个获得FDA许可进入临床试验阶段的环形RNA疗法，同时，RXRG001也是目前唯一获批用于放射性口干症临床研究的环形RNA药物。

同期，上海环码生物医药有限公司（“环码生物”，CirCode）自主研发的创新环形RNA（circRNA）药物HM2002注射液新药临床试验申请（IND）获CDE受理，用于治疗缺血性心脏病（IHD），标志着国内circRNA疗法临床申报首次获得CDE正式受理。这些重大进展标志着环形RNA药物正式进入临床开发阶段。

自复制RNA

与传统的非复制型mRNA相比，自复制RNA在骨架中巧妙地融入了源自病毒的复制酶序列。当这种RNA在细胞或生物体内被翻译成复制酶后，便能借助复制酶的能力实现目标RNA的自我复制，这种自我复制的能力使得saRNA疫苗即使在极低剂量下也能显著提高抗原表达水平，从而激发更强的免疫反应，起到四两拨千斤的效果。目前，甲病毒和黄病毒是两种主要的病毒载体，它们分别将复制酶序列置于目的基因的上游和下游。

例如，SFV（Semliki Forest virus）、VEEV（Venezuelan equine encephalitis virus）和SINV（Sindbis virus）等病毒的复制酶序列已被成功应用于临床前研究中, 2023年11月，日本厚生劳动省批准了CSL与Arcturus therapeutics联合开发的 saRNA新冠疫苗:ARCT-154，成为全球首款上市的saRNA传染病疫苗，标志着saRNA在生物医学研究和治疗中的潜力。

图4.saRNA与mRNA作用原理示意图

2023年，波士顿大学的Grinstaff Lab最新研究发表在BioRxiv上，题为“Complete substitution with modified nucleotides suppresses the early interferon response and increases the potency of self-amplifying RNA”。该研究首次筛选出与saRNA相兼容的5OHmC, 5mC和5mU三种修饰核苷酸，这一发现不仅成功抑制了早期的干扰素反应，而且相较于未修饰的saRNA，掺入修饰核苷酸的saRNA在蛋白表达水平上实现了数倍的提升^[4]。这一突破性进展彻底颠覆了现有的主流观点，即在自复制RNA中使用修饰核苷酸会抑制其表达活性，此前研究使用N1-假尿苷修饰的saRNA会抑制蛋白表达活性，较为合理的解释是 RNA 序列中修饰核苷的引入，改变了自复制 RNA 的序列结构，导致 RdRp 无法正常识别关键元件。

图5.修饰核苷酸的saRNA具有不同的蛋白表达能力

在2024年9月23日，复诺健生物的贾为国团队在《Advanced Science》期刊上发表了一篇引人注目的研究论文，题为“A Novel Self-Amplifying mRNA with Decreased Cytotoxicity and Enhanced Protein Expression by Macrodomain Mutations”^[5]。在这项研究中，团队成员通过外源干扰素的刺激，揭示了saRNA在传代过程中非结构蛋白（NSPs）的几个关键适应性突变。研究中发现，NSP3中的宏结构（Macrodomain）携带的两个稳定突变，Q48P和I113F能够显著降低其ADP核糖单体（MAR）的水解活性。这一变化导致了RNA复制的减少，但同时却增加了有效载荷的表达。与野生型saRNA相比，这些经过突变的saRNA在先天免疫反应上表现出显著的降低，这表明它们在翻译抑制和细胞凋亡方面具有更少的负面影响。

图6.突变Nsp3区域的saRNA免疫原性降低

尽管saRNA已取得初步研究进展，但仍面临一些潜在挑战。主要包括：

1. 自我复制机制研究不足：对病毒序列自我复制的机理尚缺乏深入研究，这引发了人们对其复制准确性可能带来的风险的担忧。

2. 合成工艺的开发经验不足：相较于mRNA，saRNA的分子长度通常超过三倍，这使得其在质粒模板的发酵、IVT体系的优化、LNP包封以及质量检测等方面的工艺开发亟需进一步探索和优化。

3. 免疫原性和毒性问题：由于saRNA包含病毒来源的序列，其免疫原性和毒性较高，这对药物的毒副作用和长期代谢可能构成潜在威胁。

未来展望与总结

环状RNA（circRNA）和自复制RNA（saRNA）作为下一代RNA技术平台，它们的研究和应用前景备受期待。这两种技术都有望解决传统mRNA在药效周期和作用力方面的局限性。然而，这两种技术也面临挑战。对于circRNA，如何提高体外合成效率、降低免疫原性、优化递送系统是当前研究的热点；而对于saRNA，病毒复制机制的研究不足，存在激活炎症反应的风险、非结构蛋白对细胞信号传导的干扰等是需要克服的问题。

展望未来，随着RNA技术的不断进步，circRNA和saRNA有望在疫苗开发、罕见疾病治疗、抗癌药物等领域发挥重要作用。特别是在新冠疫情的推动下，mRNA疫苗的成功为这两种技术的发展提供了宝贵的经验和信心。尽管挑战依然存在，但随着更多研究的深入和技术的突破，circRNA和saRNA的应用前景将更加光明。

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参考文献

[1]R. A. Wesselhoeft, P. S. Kowalski, D. G. Anderson, Engineering circular RNA for  464 potent and stable translation in eukaryotic cells. Nat Commun 9, 2629 (2018).

[2]Zonghao Qiu, Y. Z. et al. Clean-PIE: a novel strategy for efficiently constructing precise circRNA with thoroughly minimized immunogenicity to direct potent and durable protein expression. bioRxiv(2022).

[3]Ziwei Zhang, Yuhong Cao. Mitigating Cellular Dysfunction by Addressing Contaminants in Synthetic circRNA . bioRxiv(2024).

[4]J. E. McGee, J. R. Kirsch, D. Kenney, E. Chavez, T.-Y. Shih, F. Douam,W. W. Wong, M. W. Grinstaff, bioRxiv(2023)

[5]Yue Gong, William Jia. A Novel Self-Amplifying mRNA with Decreased Cytotoxicity and Enhanced Protein Expression by Macrodomain Mutations. Adv. Sci.(2024).