嵌合抗原受体(CAR) T细胞疗法是一种革命性的癌症治疗策略，它通过基因编辑将患者的血液T细胞改造成能够特异性识别并攻击癌细胞的强力免疫武器。目前CAR-T在血液肿瘤患者的治疗上疗效显著，但该疗法仍呈现出好坏参半的结果。其中主要的限制因素：（1）CAR-T产生的神经毒素会导致患者癫痫，脑水肿和死亡；（2）CAR T细胞毒性效应功能在体内对抗癌症抗原的持久性不足；（3）肿瘤微环境分泌或表达的分子会持续干扰免疫效应细胞的活性和浸润。

已有研究表明CAR T细胞中记忆相关基因的表达与其对患者和临床疗效的长期持久性有关，如何通过调节CAR T细胞的记忆特性来增强其疗效和持久性，成为了一个潜在突破方向。斯坦福医学院Crystal L. Mackall和费城儿童医院Evan W. Weber团队于2024年3月发表在Nature杂志上题为“FOXO1 is a master regulator of memory programming in CAR T cells”的文章，研究证明了与免疫记忆相关的转录因子FOXO1可以增加人类CAR T细胞的抗肿瘤活性，其对记忆重编程的调控可优化治疗中的CAR T细胞状态。这一发现为改进CAR T疗法提出新的思路，可使该疗法在临床应用上更为持久有效。

发表期刊：Nature

发表时间：2024年4月

影响因子：45.16

应用技术：慢病毒转染、CRISPR–Cas9基因编辑、细胞磁珠分选、流式细胞术、单细胞转录组、转录组、ATAC测序、单细胞ATAC测序、ELISA检测细胞因子、IncuCyte免疫细胞杀伤实验、免疫印迹等实验。

01 研究设计

02 主要的主要的测序结果展示

1 FOXO1对于调控记忆和抗癌活性的充分必要性

实验表明内源性FOXO1的药理抑制或基因编辑降低了记忆相关基因的表达，促进了耗竭样表型，并损害了CAR T细胞的抗肿瘤活性。转录组结果(图1d)展示了FOXO1敲除组（FOXO1KO）较于AAVS1编辑细胞（对照组），其与衰竭相关基因表达上调(DOX, NR4A1, FOS和CD69)，与记忆相关基因和FOXO1靶基因(IL7R和CCR7)表达下调，GSVA对比分析表现出FOXO1KO组低程度的幼稚状态（Navie-like）而更衰竭(Exhausted-like)的基因表达特征(图1e)。

图1. 敲除FOXO1改变CAR T细胞的记忆和衰竭相关基因表达

2 过表达FOXO1可促进记忆相关的基因特征

FOXO1过表达诱导了与 T 细胞记忆一致的基因表达程序，并增加了 FOXO1 结合基序的染色质可及性。在慢性刺激环境下，过表达FOXO1的CAR T细胞保留了其功能、记忆潜力和代谢适应性，在体内表现出增强的持久性和肿瘤控制。相比之下，TCF1 的过表达（由 TCF7 编码）并没有强制执行规范的记忆程序或增强 CAR T 细胞的效力。如图2所示主成分分析 (PCA) 表明 FOXO1OE 和 TCF1OE CAR T 细胞均与 tNGFR（对照组） 分簇聚集，且差异分析展示了过表达处理组（FOXO1OE /TCF1OE）分别具有更多的独特差异表达基因 (DEG)。GSVA分析表明 FOXO1OE 促进了幼稚态（naïve-like）且低程度末端衰竭(Exhausted-like)的基因特征（图 2c）。与这些数据一致，HA28ζ FOXO1OE细胞上调与记忆相关的基因(SELL, IL7R, LEF1和TCF7)，下调与衰竭相关的基因(TOX, HAVCR2, ENTPD1和CD244)(图2d)。GO和IPA通路分析表明FOXO1OE促进细胞自噬、细胞分解代谢以及和幼稚态相关的转录因子基因表达网络(TCF7和LEF1)，同时效应转录因子调控网络减弱(ID2、PRDM1和TBX21)(图2e、f)。

ATAC测序PCA分析表明：与 tNGFR 对照组相比，两种转录因子均促进了染色质可及性的全局变化（图 2g）。与TCF1OE细胞相比，FOXO1OE组显示出更多差异可及的峰(约5,600;P < 0.05)(图2g,h)。与tNGFR细胞(图2i,j)相比，H6.28ζFOXO1OE细胞在FOXO1靶基因位点(IL7R和KLF3)的可及性增加，与耗竭相关位点(TOX和FASLG)的可及性降低，耗竭状态的表观遗传特征减少，这与转录组数据一致。值得注意的是，FOXO1 OE/tNGFR和TCF1OE/tNGFR比较分析中排名最高的差异可及motif分别为 forkhead box和HMG box家族转录因子的DNA结合基序 (图2k,l)，该结果同时支持了过表达FOXO1和TCF1可诱导局部染色质重塑的模型。矛盾的是，FOXO1OE细胞中与效应功能相关的转录因子基序的可及性却增加(例：b-ZIP和NF-κB p65)。

图2. 过表达FOXO1非TCF1可诱导T细胞基因的表观转录特征

在FOXO1OE的背景下敲除TCF7的转录组结果表示，FOXO1OE转录重编程和体内抗肿瘤活性的影响可以忽略不计(图3d-f)。因此，FOXO1 OE 重编程需要 DNA 结合，而不是与记忆相关的转录因子和靶基因 TCF7 发生转录。

图3. 过表达FOXO1敲除TCF7的转录组差异分析

3 FOXO1OE CAR T细胞在实体肿瘤中表现出增强的肿瘤控制和持续的效应功能

为了确定FOXO1是否也能够增加CAR T细胞对实体肿瘤的活性，作者将tNGFR和FOXO1 OE HER2.BBζCAR T细胞分别注入143B骨肉瘤的NSG小鼠。与白血病模型一致，FOXO1 OE 细胞表现出持久的抗肿瘤活性和持久性。肿瘤浸润性FOXO1OE细胞表现出转录重编程，有丰富的T细胞杀伤、效应功能和组织驻留相关的基因特征，在人类Treg特征方面的差异可以忽略不计 (图4f-h)。值得注意的是，瘤内FOXO1OE细胞没有典型的记忆样表型，而展现出与bulk RNA-seq一致的 FOXO1OE 转录组特征（图 4h），这表明外源性 FOXO1 在肿瘤微环境中仍然活跃。

图4. 骨髓瘤小鼠接种 FOXO1OE CAR T细胞的单细胞转录组分析

4 FOXO1OE和tNGFR CAR T单细胞转录组分析概述

对注射FOXO1OE和tNGFR CAR T细胞的每组5只骨髓瘤模型小鼠在29天后取肿瘤做单细胞转录组实验，去除低质量细胞（1.细胞基因数大于7500或小于300；2. 线粒体比例大于10%）；使用DoubletFinder去除双细胞。样本数据整合前使用SCTransform 标准化，整合后的数据需中心化，去除高变基因和细胞周期的影响，后使用TOP30的主成分进行UMAP降维聚类分成11个cluster。根据细胞是否表达CD4或CD8分成CD4 T细胞和CD 8细胞，其中有明显基因标记特征的细胞分别注释为CD8+ 细胞毒性T 细胞（PRF1、IFNG、GZMH），CD8+前期激活细胞（Ealy activation），CD8+  TRM（组织驻留记忆）-like T细胞（ITGA1、ZNF683、GZMK），CD8+ TRM（组织驻留记忆）-like T细胞（ZNF683、GZMA），CD4激活细胞（CD4、IL2RA），其余为功能注释的细胞类群：CD8+ 细胞应激反应（热应激蛋白），CD8 G2M期（组蛋白标记或染色质分离），CD8+ S期（DNA修复），CD8+ 静止期（氧化磷酸化）。CD8+ 效应T细胞（T细胞激活）。单细胞转录组和Bulk转录组分析代码链接：https://github.com/Weber-Lab-CHOP/FOXO1_2024

03 总结

本研究为未来开发CART细胞治疗提供了新的思路，有望临床CAR T应用提高抗性的持久性。在研究方案设计上，本篇论文采用了经典的基因功能研究思路，以FOXO1为关键因子，对CAR T细胞过表达和敲减后检测其基因和功能的变化，同时还进行了小鼠造模检测了与T细胞效应功能相关的因子。这也为其它研究者提供了值得借鉴的基因验证思路。

04 参考文献

Doan A E, Mueller K P, Chen A Y, et al. FOXO1 is a master regulator of memory programming in CAR T cells[J]. Nature, 2024: 1-8.