CTX0294885

抑制实验

使用由FAK、Flt3、JAK2、JAK3、CSF-1R、SRC、VEGFR3、Aurora A、LIMK1和ROCK2组成的10个激酶的一组，用来测定评估激酶抑制曲线。在Greiner品牌的白色384孔低容积板中进行15 μL反应测定。所有反应都含有测定缓冲液，包含10 mM HEPES、pH 7.4、10 mM MgCl2、0.01％（v/v）Tween-20、50 μM Na3VO4、鸡蛋白、0.01 mM（w/v）白蛋白、1 mM二硫苏糖醇、N-末端生物素化肽底物（111 nM），ATP浓度为激酶的KM（ATP）浓度。从在DMSO中制备的11点稀释系列以100 nL的体积加入化合物，接受相同体积的无化合物的DMSO作为对照反应。以预定浓度加入激酶，通常范围在0.2至8 nM之间，阴性对照反应不添加酶。将反应物在30℃下孵育90分钟，并加入5 μL含有链霉抗生物素蛋白包被的缓冲液（10 mM HEPES pH 7.4、25 mM NaCl、100 mM EDTA、0.01％（v/v）Tween-20）供体和抗磷酸酪氨酸（P-Tyr-100）受体珠。将培养板孵育4-6小时，然后在HTS Alphascreen模式下在PerkinElmer EnVision平板读数器上读数。

细胞系

MDA-MB-231细胞

溶解方法

该化合物在DMSO中的溶解度大于21.9 mg/mL。若获取更高浓度的溶液，可在37℃下孵育10分钟，随后在超声波浴中摇匀。-20℃以下可储存数月。

反应条件

1 μM

应用

在体外，CTX-0294885表现出对广泛激酶的抑制活性，并进一步被开发成为琼脂糖支持的激酶捕获试剂。LC-MS/MS实验之后，通过大规模的基于CTx-0294885的亲和纯化鉴定了来自MDA-MB-231细胞的235种蛋白激酶，包括AKT家族的所有成员，包含之前其它广谱激酶抑制剂未鉴定出来的激酶。

注意事项

由于实验环境的不同，实际溶解度可能与理论值略有不同，请测试室内所有化合物的溶解度。

References:

[1]. Zhang L, Holmes I P, Hochgrafe F, et al. Characterization of the novel broad-spectrum kinase inhibitor CTx-0294885 as an affinity reagent for mass spectrometry-based kinome profiling[J]. Journal of proteome research, 2013, 12(7): 3104-3116.