UNC1999

临近闪烁分析法

甲基转移酶活性测定通过使用闪烁亲近测定法（SPA）监测从S-腺苷甲硫氨酸（3H-SAM）到生物素化肽底物的氚标记甲基的掺入来进行，用于PRC2-EZH2三聚体复合物（EZH2：EED：SUZ12），PRC2-EZH1五聚体复合物（EZH1：EED：SUZ12：RBBP4：AEBP2），SETD7，G9a，GLP，SETDB1，SETD8，SUV420H1，SUV420H2，SUV39H2，MLL1四聚体复合物（MLL：WDR5：RbBP5：ASH2L），PRMT1，PRMT3，PRMT5-MEP50复合体和SMYD2。 SMYD2和SMYD3的反应缓冲液是50mM Tris pH 9.0,5mM DTT，0.01％TritonX-100;对于G9a，GLP和SUV39H2是25mM磷酸钾pH 8.0,1mM EDTA，2mM MgCl 2和0.01％Triton X-100;对于其它HMT为 20mM Tris pH 8.0,5mM DTT，0.01％TritonX-100。为了停止酶反应，加入10μL 7.5M盐酸胍，随后加入180μL缓冲液，混合并转移至384孔新板。混合后，将反应混合物温育，并使用Topcount板读数器测量CPM计数。对于每个数据集，在不存在化合物的情况下的CPM计数被定义为100％活性。在不存在酶的情况下，将每个数据集中的CPM计数定义为背景（0％）。使用100nM至100μM的化合物浓度测定IC50值。使用SigmaPlot软件测定IC 50值。使用在20mM Tris pH 8,5mM DTT，0.01％Triton X-100,5μM SAM和1μM H3（1-24）肽（与野生型PRC2-EZH2复合体相同）中的30nM酶进行EZH2-Y641F测定。对于DNMT1，使用半甲基化dsDNA作为底物进行测定。通过退火由Eurofins MWG Operon合成的两条互补链（生物掺杂的正向链：BGAGCCCGTAAGCCCGTTCAGGTCG和反向链：CGACCTGAACGGGCTTACGGGCTC）来制备dsDNA底物。反应缓冲液是20mM Tris-HCl，pH8.0,5mM DTT，0.01％Triton X-100。使用过滤板进行DOT1L的甲基转移酶活性测定。将在20mM Tris-HCl，pH 8.0, 5mM DTT，2mM MgCl2和0.01％Triton X-100中的反应混合物在室温下温育1小时，加入100μL10％TCA，混合并转移至过滤板。将平板以2000rpm离心2分钟，然后另外2次10％TCA洗涤和一次乙醇洗涤（180μL），随后离心。将板干燥并加入100 μL MicroO并离心。加入70μL MicroO并且使用Topcount读板器测量CPM。

细胞系

MCF10A细胞，弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系

溶解方法

该化合物在DMSO中的溶解度> 10 mM。若配制更高浓度的溶液，一般步骤如下：请将试管置于37℃加热10分钟和/或将其置于超声波浴中震荡一段时间。原液于-20℃可放置数月。

反应时间

100nM-5μM处理2-8天

应用

UNC1999浓度依赖性降低MCF10A细胞中的H3K27me3水平，并选择性杀死含有EZH2Y641N突变体的弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系。

动物模型

雄性瑞士白化老鼠模型

剂量

15、50或150mg / kg，腹膜内注射或口服给药24小时

应用

UNC1999是可口服的、生物医学研究团体评估小鼠的长期治疗益处和潜在毒性的有用工具。 而且，UNC1999（150mg / kg，腹膜内注射）在所有测试小鼠中耐受性良好。

注意事项

请于室内测试所有化合物的溶解度。实际溶解度和理论值可能略有不同，这是由实验系统的误差引起的，属于正常现象。

References:

1Konze, K. D., Ma, A., Li, F., Barsyte-Lovejoy, D., Parton, T., Macnevin, C. J., Liu, F., Gao, C., Huang, X. P., Kuznetsova, E., Rougie, M., Jiang, A., Pattenden, S. G., Norris, J. L., James, L. I., Roth, B. L., Brown, P. J., Frye, S. V., Arrowsmith, C. H., Hahn, K. M., Wang, G. G., Vedadi, M. and Jin, J. (2013) An orally bioavailable chemical probe of the Lysine Methyltransferases EZH2 and EZH1. ACS Chem Biol. 8, 1324-1334