Ro 3306

结合实验

使用从Hi5昆虫细胞表达和分离的重组人CDK1/cyclin B1、CDK1/cyclin A、CDK2/cyclin E和CDK4/cyclin D进行CDK活性测定。使用均匀时间分辨荧光测定法在96孔板中进行测定。测定缓冲液含有25 mM Hepes、6.25 mM MgCl2、0.003％TWEEN 20、0.3 mg/ml BSA、1.5mM DTT和ATP，包含162 μM（CDK1）、90 μM（CDK2）或135 μM（CDK4）。CDK1和CDK2缓冲液含有10 mM MgCl2。将测试化合物在测定缓冲液中稀释至20 μl，稀释为最终浓度的3倍，并通过加入含有pRB底物（0.185 μM）的40 μl测定缓冲液起始反应。将板在37℃下恒温搅拌孵育30分钟，通过在25 mM Hepes/24mM EDTA/0.2mg/ml BSA中加入15 μl 1.6 μM抗磷酸化pRB抗体终止反应。在振荡温育30分钟后，加入15 μl 的在25 mM Hepes/0.5 mg/ml BSA中含有3nM Lance-Eu-W1024标记的抗兔IgG和60 nM紫杉蓝蛋白缀合的抗His-6抗体，孵育1小时。使用Victor-V多标签阅读器，激发光为340nm，发射光615nm和665nm读板。从665nm处的读数计算IC50值，并对615nm处的铕读数进行归一化。

细胞系

增殖人细胞HCT116、SW480、Hela

溶解方法

该化合物在DMSO中的溶解度大于4.4 mg/mL。若获取更高浓度的溶液，可在37℃下孵育10分钟，随后在超声波浴中摇匀。-20℃以下可储存数月。

反应条件

9 μM，20 h,

应用

在增殖的人类癌细胞HCT116、SW480和HeLa中，用RO-3306处理20小时完全阻断G2/M期的细胞周期。在癌细胞系RKO、SJSA、MDAMB-435和DU145中，RO-3306为晚期G2期的细胞同步提供了有效的手段。在HeLa细胞中，使用9 μM RO-3306阻断18小时后，停止使用RO-3306，HeLa细胞富集在有丝分裂期，随后在不存在或存在9 μM RO-3306的情况下发生了形态学变化。4 μM RO-3306处理48小时诱导癌细胞凋亡。

注意事项

由于实验环境的不同，实际溶解度可能与理论值略有不同，请测试室内所有化合物的溶解度。

References:

[1]. Vassilev L T, Tovar C, Chen S, et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2006, 103(28): 10660-10665.